疫苗接种被视为人类预防传染病传播的最有效措施之一。疫苗接种对医疗保健系统的经济影响巨大，因为它显著降低了传染病的治疗成本。此外，疫苗还有助于减少疫情爆发的影响和风险。

mRNA 疫苗的开发标志着疫苗历史上的一个巨大里程碑，尤其是SARS-CoV-2 病毒引发的 COVID-19 大流行中。这一革命性的 mRNA 技术使我们能够在细胞内生成所需的疫苗抗原，从而改变了整个疫苗领域的格局。

 

mRNA疫苗的发展历程我们目前正处于 mRNA 疫苗接种时代，这一进展得益于三十多年前的基础研究。尽管在 20 世纪 90 年代早期，曾经努力生产有效的体外转录 (IVT) mRNA 疫苗，并在动物模型中展示了表位呈现的潜力，但直到 1900 年代末，mRNA 疫苗和治疗方法才得以验证和开发。

在过去的十年里，通过以下关键方法的改进，mRNA 疫苗逐渐崭露头角：

（i）引入了加帽、加尾、点突变以及高效的纯化技术，从而提高了 mRNA 的稳定性；

（ii）通过引入脂质纳米颗粒，改善了 mRNA 的传递效果；

（iii）通过引入修饰的核苷酸，降低了 mRNA 的免疫原性，从而使其成为广泛用于疫苗的载体。

 

与传统疫苗（包括活病原体和减毒病原体、基于亚单位和基于 DNA 的疫苗）相比，mRNA 疫苗具有几个重要优势。这些包括：

（i）安全性，因为 mRNA 不会整合到宿主 DNA 中，且不具有感染性；

（ii）效能，因为 mRNA 结构的修饰可以增强疫苗的稳定性和效力，同时减少免疫原性；

（iii）生产和扩大生产的效率，因为 mRNA 疫苗是在非细胞环境中制造的，因此可以快速、可扩展地以经济实惠的方式生产。例如，一个 5L生物反应器可以在一次反应中生产一百万剂 mRNA 疫苗。此外，mRNA 疫苗能够编码多种抗原，从而增强对一些具有抗药性的病原体的免疫反应。

 

 mRNA疫苗制备流程

与其他疫苗制造过程相似，mRNA疫苗制备包括上游生产、下游纯化和最终mRNA药物的制备。

上游生产

mRNA疫苗的上游生产包括通过体外转录反应（IVT）生成含有目标基因的mRNA。这一反应需要依赖RNA聚合酶，如T7、SP6或T3等。RNA聚合酶催化线性化DNA模板中的目标基因合成mRNA。为了生成线性化的DNA模板，可以通过限制核酸内切酶切割含有目标基因的质粒或通过PCR扩增目标基因来实现。

IVT反应中所需的酶包括：

1. RNA聚合酶：将DNA转录为RNA。

2. 无机焦磷酸酶（IPP）：提高IVT反应产物的产量。

3. 鸟苷基转移酶：将GMP核苷添加到mRNA的5'末端。

4. Cap 2'-O-甲基转移酶（SAM）：在mRNA 5'帽的2'位置添加甲基。

5. DNase I：用于从RNA样品中去除污染的基因组DNA，并在IVT反应中降解DNA模板。

6. 聚(A)尾聚合酶以及修饰和未修饰的三磷酸核苷（NTP）：这些酶有助于mRNA从含有目标基因的质粒向上游合成。加帽酶包括SAM和鸟苷基转移酶，它们在mRNA的5'端酶促形成5'帽，而Poly(A)尾聚合酶加尾酶则形成Poly(A)尾。另一种5'帽添加方法是使用共转录方法，其中5'帽是预先准备好的，然后以非酶促方式添加到mRNA中。

 

下游纯化

mRNA由上游生产阶段的IVT反应产生，然后在下游纯化过程中经历多个分离和纯化步骤。IVT反应混合物中包含多种杂质，如残留的NTP、酶、错误合成的mRNA和DNA质粒模板。

实验室规模的IVT mRNA纯化步骤

首先通过DNase酶消化去除DNA，然后通过氯化锂（LiCl）沉淀法进行纯化。然而，传统的实验室方法不能完全去除异常mRNA种类，包括双链RNA（dsRNA）和截短的RNA片段。去除这些杂质对于获得高纯度的mRNA产品至关重要，以确保其预期功效和安全性。低效的纯化技术可能会导致mRNA疫苗产品的翻译效率下降以及不必要的免疫刺激特性。例如，通过反相高效液相色谱（HPLC）纯化修饰的mRNA后，观察到mRNA转染和相关蛋白质产量增加了10-1000倍。

色谱法

色谱法是生物制药行业广泛采用的纯化工艺，用于疫苗和生物药品的纯化。2004年首次发表的大规模核酸纯化RNA寡核苷酸的方法采用尺寸排阻色谱（SEC）。SEC具有多种优势，包括选择性、可扩展性、多功能性、成本效益以及实现核酸产品的高纯度和高产量。然而，SEC无法去除具有相同大小的杂质，如dsDNA。

离子对反相色谱（IEC）已被证明是一种出色的mRNA疫苗纯化技术。IEC可以轻松地将目标mRNA与IVT反应杂质分离。这种分离方法依赖于目标mRNA和杂质之间的电荷差异。IEC具有多种优势，包括分离较长的RNA转录本、更高的结合能力、成本效益和可扩展性。由于IEC在变性条件下进行，因此该过程变得复杂且对温度敏感。

基于亲和力的色谱分离是另一种mRNA纯化方法。脱氧胸苷（dT）-Oligo dT是捕获mRNA聚(A)尾的序列。含有Oligo dT的色谱珠可用于mRNA疫苗的下游纯化。切向流过滤（TFF）或核心珠过滤可用于去除小尺寸杂质。作为mRNA疫苗的最后加工步骤，疏水相互作用色谱（HIC）可能非常有益，其中使用连接到含有OH或SO3配体的结合介质（CIM）柱。这有助于进一步提高纯度。

 

mRNA的设计优化策略

在优化 mRNA 药理学方面，目前存在多种技术和策略：

• 合成帽类似物和加帽酶，通过与真核翻译起始因子 4E (EIF4E) 的结合来稳定 mRNA 并提高蛋白质翻译的效率。

• 5'-非翻译区 (UTR) 和 3'-UTR 中的调控元素，可以稳定 mRNA 并增强蛋白质的翻译。

• Poly(A) 尾，可以维持 mRNA 稳定性并提升蛋白质合成。

• 修饰核苷，降低了先天免疫激活的程度并促进了翻译过程。

• 分离和/或纯化技术：包括 RNase III 处理（NP 和 DW，尚未发表的研究结果）以及快速蛋白质液相色谱 (FPLC) 纯化，可以减少免疫激活并增加翻译效率。

• 序列和/或密码子优化，有助于提高翻译效率。

• 对靶细胞的调控：通过改变翻译起始因子和其他方法的共同传递，可以改变翻译过程和免疫原性。

   

mRNA疫苗 Q&A

Q1: mRNA疫苗接种后，抗体反应的持续时间是多久？

抗体反应的持续时间因不同抗原而异，但目前尚需更长期的数据来全面了解 mRNA 疫苗的抗体反应持续时间。

Q2: mRNA疫苗如何触发生发中心免疫原性反应？

mRNA疫苗接种后，抗原被抗原呈递细胞（APC）吸收并转运至淋巴结，促进了B细胞、APC和滤泡辅助T细胞（TFH细胞）之间的相互作用，从而形成了生发中心，B细胞在其中增殖并产生高亲和力中和抗体。

Q3: 有哪些策略用于增强mRNA疫苗的免疫反应？

一些策略包括使用APC细胞特异性配体、抗体（mAb）和肽来靶向脂质纳米粒子（LNP），以增强mRNA疫苗的免疫反应。此外，延长抗原mRNA的翻译时间也被认为是增强抗体反应的一种潜在工具。

Q4: mRNA疫苗的安全性如何？

总体而言，临床试验和真实人群数据表明，当前的mRNA疫苗具有良好的安全性，大多数不良事件都是轻度或中度的。然而，一些零星的安全事件也存在，需要对疫苗成分进行进一步优化。

Q5: 为什么有些人会对mRNA疫苗产生过敏反应？

有些人可能会对mRNA疫苗产生过敏反应，这可能与体内预先存在的抗聚乙二醇化脂质（PEG）抗体有关。这些抗体可以形成在体内，以响应许多消费品中含有的PEG。这些抗体可以加速和增加过敏反应的风险，因此CDC建议对曾经对辉瑞BioNTech或Moderna疫苗产生过敏反应的人不应接种mRNA疫苗。重新设计疫苗成分以增强安全性也被提出作为一个潜在的解决方案。

Q6: 针对老年人的疫苗有哪些挑战？

老年人更容易受感染，但老龄化对免疫系统产生不利影响，包括减少Toll样受体表达、细胞因子信号受损、胸腺退化等。这使得老年人更难接种疫苗，并且感染期间的适应性免疫反应通常不充分。然而，mRNA疫苗已经显示出在老年人中具有良好的效力。

Q7: mRNA疫苗如何在老年人和其他特定人群中显示出强大的效力？

mRNA疫苗已经在多项研究中显示出对老年人和其他特定人群具有强大的效力。这些疫苗利用了mRNA技术，通过激活免疫系统产生强有力的抗体反应，即使在老年人的免疫系统受到一些不利影响的情况下，也能产生良好的免疫保护。此外，疫苗配方的设计和使用适当的疫苗佐剂也对提高效力至关重要。

 

 安必奇 · mRNA生产 & LNP 制剂组合服务

 

安必奇生物科技拥有完善的质粒GMP生产和mRNA合成的工艺流程，致力于为医药公司、工业客户提供GMP级别的mRNA以及脂质纳米颗粒（LNP）生产服务。

 

 

 

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服务优势

• 高效：高质量GMP级别的mRNA生产服务

• 灵活：灵活可放大的生产规模，可提供从毫克到百克级别的mRNA

• 一站式服务：针对产品需求对序列优化、加帽方式选择和核苷修饰等方面进行工艺流程的个性化定制设计

• 个性化调整：提供高效并经济的最终解决方案，根据产品特征从反应组分和纯化流程上进行个性化调整

• 严格管理和保密：具有专业并经验丰富的团队、标准及完备的项目管理流程和保密机制

• 定制脂质合成服务：根据不同的需求，提供不同类型的脂质，以帮助创建稳定的脂质纳米颗粒，用于包装和保护 mRNA。可包括合成胆固醇等组件，以确保 LNP 的稳定性

• 完整性测试和无菌过滤：您提供完整性测试仪和无菌过滤器，以确保制剂的无菌性和质量。这些步骤对于制备医疗用途的药物非常重要，可以提供额外的质量保证

• 高质量和一致性：通过提供高质量的 LNP 和相关产品，以及在制备和测试方面的一致性，您可以确保客户获得高质量的制剂

 

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服务流程

• 质粒GMP生产与线性化

可根据您的需求进行mRNA序列设计及优化，并提供GMP级质粒生产和线性化模板制备的从头设计和生产服务。

• mRNA的体外转录（IVT）制备与纯化

可根据您的产品具体特征和最终需求进行优化和规模放大，满足您的需求。同时，我们也提供如报告基因、CRISPR-cas酶等基因编辑相关的现货GMP级别的mRNA产品，具体产品列表可咨询后台。

• mRNA原液的质量检测

• LNP 配方以及灌装和加工服务

 

 

关于安必奇生物

从研发到GMP生产，安必奇是您生物医药制剂开发和研究机构的理想合作伙伴！我们致力于全方位加速细胞和基因疗法产业，为您提供优质的服务和支持。

我们坚持创新发展，拥有专业且经验丰富的团队，以及完备的项目管理流程和保密机制，致力于为广大客户提供更高效、优质的一站式mRNA，环状RNA及LNP制剂生产服务。我们严格遵循国际标准和法规，确保服务在质量和合规性方面达到理想水平。

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*注：安必奇提供的所有产品或服务均不得用于人类或动物之临床诊断或治疗，仅可用于工业或者科研等非医疗目的。

本文旨在介绍生物医药研究进展,不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导,请前往正规医院就诊。

 

参考文献：

Gote, Vrinda, et al. "A comprehensive Review of mRNA vaccines." International journal of molecular sciences 24.3 (2023): 2700.Pardi, Norbert, et al. "mRNA vaccines—a new era in vaccinology."Nature reviews Drug discovery 17.4 (2018): 261-279.Qin, Shugang, et al. "mRNA-based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases."Signal transduction and targeted therapy 7.1 (2022): 166.