重组蛋白药物在疾病治疗领域的应用越来越广泛。而用于表达治疗性蛋白的工程细胞需要来源于同一原始细胞。单克隆细胞株在遗传稳定性，克隆体系稳定性以及实验结果稳定性等方面均具有独特的优势。因此，开发适宜的单克隆细胞株对于重组蛋白药物的开发尤为重要。

 

 单克隆细胞株构建策略

细胞株开发过程中，宿主细胞选择、表达载体构建、转染方法、筛选技术、细胞培养工艺技术方法以及最后选定细胞株的标准等对于细胞株的开发都至关重要。在实际操作中，需要根据具体的实验条件和实验目的对不同步骤进行筛选和优化，从而获取细胞活力高，生长能力强，同时表达水平，表达稳定性，质量情况都好的单克隆细胞株。

宿主细胞选择

哺乳动物细胞是临床抗体药物产品使用的主要表达系统。对于治疗性抗体而言，正确的折叠和翻译后修饰才能保证抗体的生物活性，因此用于生产治疗性抗体的宿主细胞往往是哺乳动物细胞。

主要的细胞类型有：Sp2/0 骨髓瘤细胞、NS0 小鼠骨髓瘤细胞、HEK293人胚胎肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其中以CHO细胞用途最为广泛。

CHO细胞在重组蛋白药物生产领域具有独特的优势。目前，几乎所有的抗体药的生产均来自于CHO。同时，重组生物药的生产也以CHO细胞为主。

CHO细胞的优势

• 符合FDA批准的监管途径，有助于后续相关药物的上市流程；

• 产生的抗体分子在结构、功能方面和天然抗体分子较接近；

• 外源基因可以在CHO细胞中稳定地整合；

• 所含人类病毒极少；

• 提供“人样”糖基化特征，可阻止患者免疫反应的激活；

• 适用于悬浮培养，可实现大规模生产。

 

表达载体的构建

生产用稳定细胞株的构建首先由表达载体的构建和细胞转染开始，将表达抗体的目的基因构建到载体上，再将该载体转染进入宿主细胞内。DNA进入宿主细胞核后将会随机整合到宿主细胞基因组中，因此其表达水平与基因拷贝数、基因整合位点的转录活性有关。然后，不同筛选试剂将被用于筛选能够正确表达目的基因并且高水平表达的细胞池。

由于此时得到的细胞池中的每个细胞特性各异，具有不同的基因整合位点、拷贝数、细胞单产和生长速率，因此需要将其中具有高产、稳定表达特性的细胞个体分离出来分别培养，通常需要获得数百甚至上千的候选克隆供进一步筛选。

被筛选出来的克隆经过传代培养和分批补料（fed-batch）实验，比较其生长特性、代谢状况、表达量高低、表达产物质量等因素，选出最优的几个克隆进入生物反应器放大实验，最终确定生产用单克隆细胞株。

常见的转染方式主要有：

• 磷酸钙转染

• 电穿孔转染

• 脂质体转染

• 逆转录病毒转染

 

转染方法

转染类型一般有稳定转染和瞬时转染两种。

在单抗细胞株筛选稳定转染前通常通过瞬时转染得到一些抗体，进行质量分析，以初步判断抗体是否满足需要，或者进行一些组件优化。

稳定转染中外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。在CHO细胞中进行稳定转染时，外源DNA整合到CHO染色体上，未整合的游离态的DNA会随传代而丢失。

高表达细胞株的筛选

筛选高表达单克隆细胞株是细胞株构建的关键步骤。一般通过衡量抗体表达量、产品质量、代谢稳定性、细胞稳定性等指标确定高表达单克隆细胞株。

当目的基因被转染到宿主细胞内，并按照一定的细胞密度在合适的筛选压力下进行传代培养后便得到了细胞池。细胞池的表达量取决于转染的方式、筛选压力的作用以及目的基因整合情况。由于目的基因整合具有很大的随机性，即使用相同的方法进行转染和筛选，表达量依然会体现出极大的差异性，接下来就要从细胞池中筛选出高产稳定的细胞株。

目前常用的单克隆筛选方法主要包括有限稀释法、ClonePix、和流式细胞荧光分选技术（FACS）。

• 有限稀释法挑选单克隆

有限稀释法是传统的挑选单克隆的方法，也是目前应用较多的单克隆挑选方法。在实际使用中，可以用单克隆成像系统对实验方法进行优化。

由于有限稀释法对人工依赖比较高，不同操作人员的操作习惯的差异和方式方法的差异都会影响实验结果，因此计划使用该方法的科研机构或公司需建立自己的平台方法同时使用固定的操作人员以减少误差。

• ClonePix挑选单克隆

ClonePix是一种高通量的单克隆筛选设备。该方法一般使用6孔板或平皿在半固体培养基中挑选单克隆。在实际操作中，通过对稀释比例等条件进行优化可以极大地提高单克隆率。

• FACS挑选单克隆

FACS法是根据细胞大小，荧光染料和细胞表面marker等因素挑选出所需要的单细胞。目前广泛应用于单细胞分离，稀有细胞分选等研究中。在利用FACS法挑选单克隆时，需要对条件进行优化以获得更高的单克隆形成率。

 

细胞培养工艺的优化

细胞培养工艺对最终生物制品的产量、质量和安全有很大影响，其中以细胞培养基的选择最为重要。

在筛选培养基和补料培养基时，应该对初期流加培养时基础培养基和同品牌的补料培养基进行配对筛选。初步筛选之后，将基础培养基和补料培养基进行分类，如促进生长类型、维持活率类型、促进表达类型等。将培养基进行混合优化时，尽量将不同类型的培养进行组合，并且应用实验设计优化。

 

 FISH技术验证单克隆源性

单克隆源性是产品表达和质量均一性的重要的前提和保证。而单克隆源性鉴定报告也是药物申报的重要材料。而荧光原位杂交技术（FISH）可以进行可视化外源基因整合位点，提供可视化的单克隆源性验证结果，使结果更具有说服力。

荧光原位杂交技术（FISH）是一项先进的技术。它是利用荧光检测系统对DNA进行定性、定量或相对定位分析的技术。

FISH的工作原理是根据DNA序列的互补性，用已知的荧光素、生物素标记的核酸探针与待测样本的DNA进行杂交，形成可检测的双链核酸杂交。

FISH的优势

• 安全性高：FISH是一种非放射性元素标记；

• 实验周期短：可同时检测多种序列；

• 灵敏度高：FISH因多次免疫化学反应增强了杂交信号。

  安必奇 · 工程细胞单克隆源性验证

 

随着生物技术药物的发展，重组蛋白药物在疾病治疗领域发挥越来越重要的作用。而工程细胞单克隆源性验证是保证产品表达和质量均一性的重要因素。

凭借先进的技术平台和丰富的实战经验，安必奇生物推出了工程细胞单克隆源性验证服务。我们可以使用荧光原位杂交(FISH)来确认转基因的整合均一性并确定其染色体带位置。

支持中美双报，通过我们的协助，众多客户的细胞产品已成功上市。

 

 

01

服务优势

专业高效：确认细胞系单克隆源性（可检测200个细胞）

支持多个物种：人类，小鼠，大鼠，仓鼠(CHO细胞系)等

快速：4-6周即可获得可视化数据和实验结果

定制化服务：可以根据客户的要求提供定制化服务，可视化染色体带位置

 

 

 

 

关于安必奇生物

从研发到GMP生产，安必奇是您生物医药制剂开发和研究机构的理想合作伙伴！我们致力于全方位加速细胞和基因疗法产业，为您提供优质的服务和支持。

无论您是寻求细胞系建立、转基因验证、细胞库检验和质量管理还是GMP生产，我们都能够为您提供定制化的解决方案。我们严格遵循国际标准和法规，确保服务在质量和合规性方面达到理想水平。

与北京安必奇合作，您将拥有可靠的技术支持、高效的项目管理和灵活的合作模式。期待与您在未来合作！

 

*注：安必奇提供的所有产品或服务均不得用于人类或动物之临床诊断或治疗，仅可用于工业或者科研等非医疗目的。

 

版权说明：本文来自北京安必奇，感谢关注、转发。欢迎媒体/机构转载，转载请注明来自“北京安必奇生物”。