什么是细胞的单克隆源性

细胞单克隆源性（Cell Clonality）是指细胞群体中是否存在来自单个细胞的后代细胞。在细胞群体中，如果所有的细胞是从同一起源细胞分裂产生的，那么这个细胞群体就是细胞单克隆的，也就是说具有细胞源性单一性。相反，如果细胞群体中的细胞来自多个细胞的分裂产生，那么这个细胞群体就是多克隆的，也就是说具有细胞源性多样性。

 

单克隆鉴定的目的

目前的国际医药市场中，生物药处于主导地位。这些药物多是由工程细胞株表达的重组蛋白。在开发用于生产治疗性蛋白质的细胞系的过程中，含有转基因产物的载体被整合到基因组中。为了确保生产稳定性和一致的产品质量，应该进行单细胞克隆性验证。具体来讲，工程细胞的单克隆性鉴定的目的包括：

遗传稳定性验证

通过源性验证可以确认细胞克隆的遗传背景是一致的，避免了由于多细胞混合而导致的遗传差异。

保证实验结果的可靠性

多细胞混合会导致实验结果的不确定性，因为每个细胞可以有不同的遗传和表达特点。只有源自单一细胞的克隆才能保证实验结果的可靠性。

避免细胞杂交的影响

在工程细胞中，细胞杂交是一个常见的问题。通过源性验证可以确认克隆的细胞不带有外源性DNA，避免了细胞杂交对实验结果的影响。

提高克隆体系的稳定性

通过单克隆源性验证可以筛选出源自于单一细胞的克隆，进一步提高工程细胞体系的稳定性。这对于研究和应用都非常重要。

 

国际医药市场对工程细胞单克隆源性的要求

为了确保细胞随着时间的推移产生的产品的一致性和质量，监管机构需要证明克隆性，即细胞源自单个转染的祖先细胞。当前医药行业已经形成共识：用于表达治疗性蛋白的工程细胞需要来源于同一原始细胞，原因在于工程细胞的单克隆源性是产品的质量、表达量稳定性的必要条件，因此目前工程细胞的单克隆源性在药品报批过程中被重视的程度越来越高。

国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q5B中说明了主细胞库通常来自选定的含有表达构建体的细胞克隆。Q5D中要求“对于重组产品, 细胞系是指克隆自一个祖细胞且含有所需序列的转染细胞”。

世界卫生组织(WHO)的技术报告系列TRS978附录3中也明确要求“克隆过程应被完整记录, 包括成像细节和/或适当统计资料”以及“对于用重组质粒DNA技术转染来源的蛋白, 若能够在定义的传代代次内, 生产工艺可证实均一和一致的产品质量, 则单次完整记录的克隆是足够的。

我国发布的《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》中对杂交瘤细胞要求应“采用适宜的方法进行融合、筛选及克隆化”, 要求含表达载体的宿主细胞应经过克隆而建立主细胞库。

 

新细胞系的单克隆筛选

线性化的重组质粒DNA转染宿主细胞后可筛选得到细胞群, 将细胞群以一定的密度铺板至微孔板中, 可以实现单克隆化。这个单克隆化过程可采用有限稀释法(limiting dilution)完成, 其结果符合泊松分布, 可以采用excel等常用数据处理软件计算单克隆的概率。

除了经典的有限稀释法, 近年来基于流式细胞术的单细胞分选(FACS)、克隆筛选单细胞打印系统、ClonePix高通量细胞克隆筛选系统、下一代测序( NGS)、细胞成像技术等新技术也逐渐应用于细胞克隆化或者用于确认单克隆性, 为研究者提供了更高效稳健的筛选手段和文档记录。

 

细胞系的单克隆源性验证

虽然上述方法适用于新生成的生产细胞系，但对于在此要求到位之前已亚克隆和分离的已建立细胞系来说，它们会失败。除了上述单细胞记录方法之外，还可以使用补充技术来实现此目的。其中包括用于检测特定基因组片段中是否存在重组基因的 Southern 印迹技术、用于识别精确基因组整合位点的连接 PCR 或靶向基因座扩增 (TLA) 以及用于检测基因组整合位点的荧光原位杂交（FISH）。

用于验证单克隆源性的FISH技术

FISH的原理是通过检测工程细胞染色体插入位点是否一致来确定细胞库（一般是主细胞库MCB）是否来源，该方法是在没有成像证据的情况下，证明工程细胞单克隆源性的有利补充实验。

同时，由于FISH可以检测到细胞株染色体插入拷贝的变化，因此FISH同样可以筛除某些虽然来源于单一细胞但由于插入位点不稳定或一些不利突变而导致有可能在后期放大过程存在风险的克隆。

FISH技术在评价工程细胞单克隆源性方面的优势

当监管部门对于申报的细胞株单克隆源性存疑的时候，可以采用有限稀释法获得亚克隆的方法来解决。但是通过额外的有限稀释来重新获得克隆细胞系既费时又昂贵，而且至关重要的是，可能会影响细胞系的生产和生长速率。当提交审核材料的时间线很短时，这是尤其不受欢迎的。

由于源自相同亲本克隆的细胞具有相同的转基因整合位点，因此整合位点的身份也可用于验证生产细胞系的克隆性。FISH可用于可视化外源基因整合位点并提供对外源基因的整合是否均一等数据和信息，在短时间内提供更直观更有说服力的数据。FISH技术的优势包括：

• FISH标记使用非放射性元素，因此更安全

• FISH实验周期短，可以同时检测多个序列

• FISH的灵敏度与放射性探针相当，这是因为进行了多次免疫化学反应，从而增强了杂交信号

 

安必奇·单克隆源性验证服务（FISH）

荧光原位杂交(FISH)是一项功能强大的技术，可用于可视化外源基因整合位点并提供对外源基因的整合是否均一等数据和信息，在短时间内提供更直观更有说服力的数据。北京安必奇生物科技有限公司可以通过 FISH技术提供工程生产细胞系的遗传特征数据，我们可以使用荧光原位杂交(FISH)来确认转基因的整合均一性并确定其染色体带位置，为客户提供有关转基因完整性和整合位点的信息。并且我们已经为多家工业生产的企业完成了工程细胞系单克隆验证服务。 服务流程

探针设计及合成

中期染色体的制备

原位杂交试验

拍照

结果分析及项目报告

 

服务优势

专业高效：只需要提供cDNA(长度至少2kb)/基因组DNA片段/基因ID等信息

支持多个物种：人类，小鼠，大鼠，仓鼠(CHO细胞系)等

高通量：可检测200个细胞

快速：服务周期短（4-6周）

定制化服务：可以根据客户的要求提供定制化服务，可视化数据结果

 

*注：安必奇提供的所有产品或服务均不得用于人类或动物之临床诊断或治疗，仅可用于工业或者科研等非医疗目的。

本文旨在介绍生物医药研究进展,不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导,请前往正规医院就诊。

 

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