浅谈蛋白质表达系统

蛋白质表达系统是一项通过基因重组技术来实现蛋白质外源表达的分子生物技术。无论是原核还是真核，不同的表达系统在不同的情况下展现出独特的优势。

在生物药物研发中，选择适合的表达系统能够更有效地生产出高质量的重组蛋白，为药物研究和开发带来新的可能。

 

 

原核生物表达系统

原核生物表达系统被用于进行蛋白质重组表达的宿主微生物体系，在蛋白质表达领域扮演着重要而主导的角色。该表达系统常以大肠杆菌（Escherichia coli）作为宿主细胞，其具备明晰的遗传学和生理学特性，以及周期短、成本低、操作简便、表达效率高等诸多优点。

然而，尽管原核生物表达系统具有诸多优势，但其存在着诸多局限性，为随后的蛋白质纯化等步骤带来诸多困难与挑战。

局限性

• 包涵体形式表达：通常，目标蛋白质在原核表达系统中以包涵体的形式表达，这导致后续的产物纯化过程变得困难。

• 不完善的翻译后修饰：原核生物表达系统的翻译后修饰体系相对不完善，无法进行例如糖基化、甲基化等关键修饰，这可能影响某些表达产物的生物活性和功能。

• 细菌毒素的影响：原核生物表达系统中，可能存在细菌毒素的产生，这可能对目标蛋白质的结构和功能造成不利影响。

• 对真核蛋白质的限制：对于真核蛋白质的表达来说，不仅易受细菌蛋白酶降解，而且很难实现有效的胞外分泌，从而导致产量较低。

 

酵母表达系统

酵母表达系统兼有原核和高等真核系统的优点，是真核表达蛋白的常用系统之一，融合了原核表达与真核表达平台的优点：如培养条件简单、表达水平高、操作简便、成本低廉，蛋白翻译后能进行正确加工、修饰，合理的空间折叠，使得蛋白的可溶性得到提高，是较优的重组真核蛋白生产制备的工具。

酵母系统主要包括两种常用的酵母细胞：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）。这两种酵母细胞在蛋白质表达方面都有其独特的优势和应用。

酿酒酵母表达系统

酿酒酵母是被用于蛋白质表达的酵母细胞之一。它的主要优势包括：

• 相对简单的培养条件：酿酒酵母在常规培养条件下可以快速生长和繁殖，提供了大量的细胞用于蛋白质表达。

• 遗传工具丰富：酿酒酵母的遗传工具和基因组信息非常丰富，使得基因操纵和表达调控更加便捷。

• 蛋白质翻译后修饰：酵母细胞可以进行一些蛋白质翻译后修饰，如糖基化等。

但酿酒酵母也有一些限制，例如蛋白质表达量较低，易产生过量糖基化，转化子不稳定等。

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母作为第二代酵母表达系统，克服了一些酿酒酵母的限制，并且具有以下优势：

• 高蛋白质表达水平：毕赤酵母能够产生较高水平的蛋白质表达，适用于大规模蛋白质生产。

• 蛋白质修饰能力：毕赤酵母具有更强的蛋白质修饰能力，包括O-糖基化、N-糖基化和二硫键形成等。

• 可诱导的启动子：毕赤酵母可以使用诱导启动子控制蛋白质表达，使得表达调控更加精细。

除了酿酒酵母和毕赤酵母，还有其他一些酵母细胞，如乳酸克鲁维酵母和解脂耶氏酵母，也被用于特定类型的蛋白质表达。

酵母表达系统的组成元件

载体（Vector）

载体是用于携带外源基因并在宿主细胞中复制、扩增和表达的DNA分子。载体通常是由多个功能区域组成，包括选择标记、启动子、终止子、多聚腺苷酸酶、放大子等。

• 选择标记（Selection Marker）：选择标记是一种基因，通常与宿主细胞的生存或生长所需的营养物质或抗生素抵抗性相关。在转化过程中，只有带有载体的细胞才能在选择培养基中生长。例如，使用草酰胺酶基因（如URA3）作为选择标记，细胞将对尿嘧啶类似物耐受。

• 启动子（Promoter）：启动子是控制外源基因转录的序列，在酵母表达系统中，一般会选择适合的启动子来驱动目标基因的转录。常用的启动子包括酵母本身的启动子，如PGK1、ADH1等，也可以选择其他的启动子，以调节蛋白质表达水平。

• 终止子（Terminator）：终止子是标志基因转录终止的序列，它有助于确保转录过程的正常终止。

• 多聚腺苷酸酶（Polyadenylation Signal）：这个序列指示蛋白质编码区域的末端，促使转录过程产生多聚腺苷酸尾巴，有助于mRNA的稳定性和转运。

• 复制起始点（Origin of Replication）：这个区域允许载体在宿主细胞中复制和扩增，确保多份复制的载体在细胞中存在，从而增加蛋白质表达量。

调控序列

调控序列包括启动子和转录调控因子（如激活子和抑制子），用于控制外源基因的表达水平和时机。调控序列的选择取决于所需的蛋白质表达量和表达时机。

在毕赤酵母表达系统中，还可以使用可诱导的启动子，如AOX1启动子。这种启动子在适当条件下（例如添加甲醇）会被激活，从而调节蛋白质表达。

 

 昆虫杆状病毒表达系统

杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达系统是常用的蛋白表达系统之一，是真核环境中高效表达外源蛋白的有利工具。该系统有着真核系统的传统优势，表达量可高达昆虫细胞蛋白总量的50%，并且具备有效表达具有较大分子质量（高达200kD）的外源基因的能力。也兼具原核表达系统的高效表达的特点，能够实现在同一载体上进行不同种蛋白的表达，为复杂蛋白互作研究或多蛋白协同表达提供了独特的机会。

 

杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达系统

杆状病毒不会感染脊椎动物，昆虫细胞表达系统还具有翻译后修饰的功能，尤其适用于对哺乳动物细胞产生毒性的蛋白的表达，通过昆虫细胞表达系统生产的重组蛋白可用于疫苗生产，基因治疗，杀虫剂等方面。

 

哺乳动物表达系统

哺乳动物细胞表达系统能够为重组人源蛋白提供较接近于天然状态的翻译后修饰，能在蛋白表达过程中会形成接近天然蛋白的蛋白质折叠和聚合，具备活性蛋白所必须的空间结构和修饰。

由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面高于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。这一特性使得哺乳动物细胞表达系统在重组蛋白药物，特别是治疗性重组单抗药物的研发和生产中的应用。

 

 

哺乳动物表达系统可分瞬时表达系统和稳定表达系统：

瞬时表达系统

瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。

稳定表达系统

当需要大量重组蛋白质时，建议构建稳定表达系统，以实现蛋白质生产的可重复性和成本效益。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和人类胚胎肾（HEK）细胞是高效、多产的生物工厂之一，它们的培养物被广泛用于生产新型细胞系。稳定细胞系可用于长期连续生长，目标基因的表达水平不会发生明显变化。它广泛应用于基因功能研究、蛋白质生产和药物筛选。

 

蛋白质表达系统选择指南

在选择蛋白质表达系统时，需要综合考虑所需蛋白质的特性、后续实验需求以及制备规模等因素。每种系统都有其独特的优势和局限性，选择适合的系统将有助于提高蛋白质的产量和质量，推动生物药物研发的进程。 在选择适合的蛋白质表达系统时，研究人员必须仔细权衡多个因素：

• 蛋白质性质：蛋白质的大小、复杂性和所需的翻译后修饰将直接影响表达系统的选择。大多数原核生物表达系统（如E. coli）适用于小型、简单蛋白质，而复杂的蛋白质可能需要使用哺乳动物细胞来确保正确的折叠和修饰。
• 产量需求：研究人员必须考虑所需蛋白质的产量，以及宿主细胞是否能够满足这些需求。高产量表达可能需要使用更复杂的系统，如哺乳动物细胞，但也可能会增加成本和复杂性。
• 折叠和修饰：一些蛋白质需要特定的翻译后修饰才能发挥功能。哺乳动物细胞常常能够提供更接近自然状态的修饰，而原核生物则可能无法满足这些需求。  

 

安必奇·一站式蛋白表达服务  

 

重组蛋白表达技术可用于多种下游应用，包括基因调控分析、蛋白结构及功能分析、蛋白质间相互作用分析等。对于特定的应用，使用正确的蛋白表达系统是实验成功的因素。在选择蛋白表达系统时，所需考虑的因素是功能性、可溶性、速度及得率等。 安必奇生物依托经验丰富的留美科研人员和专业的蛋白表达、纯化技术，可提供基于原核、酵母、昆虫杆状病毒、哺乳动物细胞等多种蛋白表达系统的蛋白定制服务。 

  

 服务优势：

• 高成功率：在我们的原核和真核表达系统中已经成功表达大量蛋白

• 保证产品活性：支持复杂的糖基化修饰，蛋白质活性高

• 高表达水平：我们的无血清悬浮哺乳动物细胞培养（HEK293和CHO）在一个月内可产生数克级蛋白

• 多种表达系统：瞬时表达、稳定细胞株表达、营养缺陷型细胞株表达(DHFR/GS)、大规模悬浮细胞表达等

 

 服务流程：

• 密码子优化，载体构建和目的基因的亚克隆

• 重组蛋白表达评估

• 蛋白纯化及鉴定

• 大规模蛋白表达和纯化（可选）

 

*注：安必奇提供的所有产品或服务均不得用于人类或动物之临床诊断或治疗，仅可用于工业或者科研等非医疗目的。

本文旨在介绍生物医药研究进展,不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导,请前往正规医院就诊。

 

参考文献：

Mendoza-Rojas, Gabriel, et al. "A low-cost and open-source protocol to produce key enzymes for molecular detection assays." STAR protocols 2.4 (2021): 100899.

van Oers, Monique M. "Opportunities and challenges for the baculovirus expression system." Journal of invertebrate pathology 107 (2011): S3-S15.