FISH探针——透视人和动物遗传物质的神奇工具

荧光原位杂交（FISH）

当谈到生物医学研究和临床诊断时，荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种非常重要的工具。荧光原位杂交是应用荧光标记物标记已知碱基序列的核酸分子作为探针，与组织、细胞中待测的核酸按照碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体从而对组织细胞中的待测核酸进行定性、定位和相对定量分析的一种研究方法。

 

FISH特异性探针的分类

序列重复探针

(1) α卫星DNA探针

此类探针序列位于染色体的着丝粒处，并且序列高度重复，容易产生非特异结合。因此，要取得较好的特异性，必须进行严格的杂交后水洗。α卫星DNA是人类染色体中的一种高度重复序列，存在于所有体细胞染色体的相同位置。该探针通常被标记为荧光染料，如荧光素或罗丹明，以便在显微镜下可视化。

α卫星DNA探针主要用于染色体数目的检测和标记染色体来源的鉴定，亦可用于间期细胞中染色体的大规模筛选。

(2) β卫星DNA探针

β卫星DNA是人类染色体中的一种高度重复序列，存在于某些染色体的特定区域，如染色体9和染色体16的着丝粒区域。此类探针除可用于染色体数目的检查外，还可用于检测端粒部位的重复序列。

(3) 经典卫星探针

经典卫星DNA有AATTGG短片段重复。卫星DNA是染色体上的一种特殊序列，位于染色体1、9、15、16和Y染色体长臂的异染色质周围，呈现为染色体上的明亮小点或颗粒。经典卫星FISH探针可以与这些卫星DNA序列特异性地结合，通过荧光信号的检测，可在显微镜下观察到这些卫星DNA序列的位置和分布。

位点特异性探针

这类探针一般呈单拷贝，有区域特异性，长度为15~500kb不等。主要用于特定的遗传病的诊断及染色体微缺失综合征的诊断，如普拉德-威利(Prader-Willi)综合征、迪格奥尔格综合征(DiGeorge syndrome)等。

位点特异性探针通常是通过基因组克隆来获得的，其大小取决于所使用的克隆载体的性质。这些载体可以包括质粒，其大小通常在1-10 kb之间，也可以是较大的PAC（P1噬菌体衍生的人工染色体），其大小可达100-300 kb，或者是YAC（酵母人工染色体），其大小可达150-350 kb，还有RAC载体，其大小范围从80 kb到1 Mb不等。

全染色体涂染探针

此类探针是将某一特定的染色体上所携带的DNA用荧光素标记而成，具有严格的染色体特异性，广泛应用于遗传病和肿瘤的检测。在全染色体涂染FISH中，通常使用多个FISH探针，每个探针都标记有不同颜色的荧光染料。这些探针被设计成与染色体上的特定序列高度互补，因此它们可以与目标染色体上的相应区域结合。通过同时使用多个探针，可以对整个染色体进行涂色，从而实现对整个染色体的可视化。

 

FISH特异性探针的制备与标记

FISH探针的设计

探针设计/选择是FISH 成功执行的最重要因素之一。选择最佳探头必须考虑几个参数。

(1) 探针长度

由于特异性、杂交温度和时间部分取决于探针长度，因此该参数对于成功杂交至关重要。探针的长度通常为 15-30 个核苷酸。如果探针太长，对靶标的选择性降低，形成分子内结构的可能性增加。另外，合成收率低，杂交时间较长，探针的合成成本较高。相反，长度很少的探针可能缺乏特异性；靶序列可能存在于大量的生物靶标中。DNA探针的长度至少为18个核苷酸，PNA探针可以包含13-18个碱基，而LNA探针的长度可以包含10-15个核苷酸。

(2) 总体ΔG°

总体吉布斯自由能变化是一个热力学参数，可用作反应热力学是否有利的指标。众所周知，对于DNA探针，ΔG°应在-13至-20kcal/mol之间，以最大限度地提高杂交效率而不影响特异性。

(3) 熔解温度（Tm）

Tm定义为50%的核酸链形成双螺旋、其余 50% 为单链时的温度。较高的预测 Tm 通常比具有较低 Tm 的探针提供更好的结果。

(4) 嘧啶含量 (GC)

GC 含量可能提供有关杂交强度的信息。对于GC含量低的探针，可能需要延长探针序列以将Tm保持在推荐范围内，因为GC含量和Tm严格相互依赖。

(5) 互补探针序列

应避免探针内具有超过三个核苷酸的自互补区域。

(6) 二级结构

二级结构的存在是设计探针时要考虑的重要因素。这大大减少了反应中可用于结合的核苷酸的数量。探针中发夹环的存在降低了 FISH 效率，限制了探针与靶位点结合的能力。

(7) 特异性和灵敏度

高特异性值意味着探针仅检测其设计的目标。高灵敏度值意味着探针可以检测到探针设计所针对的目标分类群的所有目标。

FISH探针的标记方法

(1) 直接法FISH标记

FISH有直接法和间接法两种。直接法是将已知碱基序列的特异DNA片段作为探针，并标记上不同的荧光素，在组织切片、间期细胞及染色体等标本上与靶核酸进行DNA-DNA原位杂交，因所形成的杂交体带有荧光素，故可在荧光显微镜下直接观察结果，常用的荧光素有：

• 异硫氰酸荧光素（FITC）

• 得克萨斯红（Texas red）

• 羟基香豆素（hydroxycoumarin）

• 罗丹明（rhodamine）

• 四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethy-rhodamine isothiocyanate，TRITC）等。

(2) 间接法FISH标记

间接法FISH之探针是非荧光标记的，如生物素等标记的探针，再通过亲和连接或免疫反应带入各种发光物质来检测杂交体的存在。因为有杂交信号放大作用，从而增加了杂交的敏感性，也降低了实验成本，是目前使用较多的方法。

多色FISH技术就是利用间接法，它采用三种或三种以上不同的半抗原，如生物素标记探针，然后用不同颜色的荧光素，如FITC（绿色）、罗丹明（红色）和瀑布蓝（cascade blue，蓝色）标记抗体进行检测，可同时得到多种不同颜色的荧光信号，这种方法可以在同一标本上同时检测多个基因，在检测遗传物质的突变和染色体上基因定位等方面得到了广泛的应用。

 

 

人类和动物FISH探针的应用 

基因进化的研究

用同一DNA链去标记不同种属细胞的染色体，可以找出不同种属间的同源基因，以及基因在染色体上的位置，从而了解种属间的进化关系。

染色体稳定性研究

使用荧光原位杂交，可以可视化和量化染色体改变，如扩增、缺失和易位。

人类基因图谱绘制

FISH技术可以直接确定DNA链在染色体上的位置，标记相近的DNA链，决定其在染色体上的线性序列以及DNA附着处的染色质，而后者影响到杂交位点的分辨。用DNA链作为探针，且它们在染色体上的距离大于1Mbp时，可以用不同的颜色标记两个不同的DNA链，以分辨它们在染色体上的顺序。

遗传毒理学

FISH技术已成为遗传毒理学研究中的重要工具之一。FISH技术利用特异性探针可以快速检测出染色体结构及数量上的畸变。

(1) 辐射致畸作用的生物学评估

由于FISH技术的快速性和有效性，以及对静态染色体畸变、易位分析的预测性。FISH技术还可用于接触甲醛、砷等物质后染色体畸变率的测定等方面。

(2) 非整倍体的检查

利用FISH技术可检测出分裂间期和分裂中期细胞的非整倍体以及致畸活动的发生，以评估这些物质的致畸或致突变作用。

产前诊断

FISH技术现已用于产前诊断中。有不少的研究小组利用FISH技术进行间期核染色体、非整倍体和嵌合体的检测分析。FISH技术还可检测羊膜或绒毛膜细胞的染色体是否异常。通过检测这些细胞中的性染色体，可对某些性连锁遗传病进行产前诊断。

肿瘤细胞遗传学研究

FISH技术可用于间期核、石蜡切片标本，并且灵敏，有助于肿瘤的细胞遗传研究。采用多个探针，以不同的颜色标记，同时检测间期细胞，更适用于实体瘤细胞染色体数目改变的异质性研究。

 

 

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参考文献：

Torres-Ruiz, R., Grazioso, T. P., Brandt, M., Martinez-Lage, M., Rodriguez-Perales, S., & Djouder, N. (2021). Detection of chromosome instability by interphase fish in mouse and human tissues. STAR Protocols, 2(3), 100631.