环状RNA是一类独特的非编码RNA分子。与传统线性RNA不同，circRNA通过反向剪接过程形成了一个共价闭合的环。不仅结构更加稳定，而且CircRNA在许多细胞中丰富存在，具有多样的细胞内功能，包括作为miRNA海绵、蛋白质海绵、mRNA调控因子等。随着circRNA研究的不断发展，其在医学应用中的重要性也不断增加，包括circRNA疫苗和基因治疗。

自从2012年在人体细胞中发现大量circRNA以来，相关文献和引用数量逐年增加，且持续增长。这些研究推动了环状RNA的生产和合成大环状RNA分子的进展，从而扩大了环状RNA的潜在应用领域。

 

环状RNA的体内合成

EcircRNA 是主要的 circRNA，主要通过体内反向剪接的过程产生。EIciRNA 和 ciRNA 由其他环化反应产生并位于细胞核中。

 

 circRNA的体外合成策略 

目前，体外合成circRNA的主要方法涉及连接线性RNA前体的末端，从而形成共价封闭的环结构。线性RNA前体可以通过化学合成或酶促策略来制备。

 

化学合成环状RNA 

目前，环状RNA的化学合成技术主要基于磷酰胺（phosphoramidite）化学和固相合成方法，使用天然核苷三磷酸酯衍生物作为原材料。这些衍生物使用非活性保护基团替代天然核苷三磷酸酯中的反应性氨基和羟基，以便实现3’-5’磷酸二酯键的连接，并在之后去除保护基团，同时减少2’-5’磷酸二酯键的形成以及其他副反应的发生。化学合成的优点是可以在合成过程中直接引入5'单磷酸盐来进行环化。

经过合成后的处理和纯化步骤，可以获得高纯度的寡核苷酸。然而，受到纯化成本高和产量低的限制，化学合成只能生成长度小于50至70个核苷酸的RNA。

因此，酶促策略目前是主要的商业化合成方法。

 

酶促策略合成环状RNA

 

酶促策略通常涉及体外转录（IVT）反应，包括使用DNA模板、反应缓冲液以及噬菌体RNA聚合酶。噬菌体RNA聚合酶通常源自T7、SP6或T3噬菌体，其中T7 RNA聚合酶是常用的选择。IVT 反应在更低的成本下能够实现更长的RNA合成，因此酶促合成目前是环状RNA的主流制备方法。

需要注意的是，野生型噬菌体聚合酶具有run-off特性，可能导致合成不完整的RNA序列。因此，一些研究人员通过对野生型噬菌体RNA聚合酶进行突变，以改善体外转录的质量并减少副反应的发生。酶促连接方法可以进一步分为T4连接酶连接和核酶连接两种。

 

T4连接酶

噬菌体T4提供多种连接酶，用于催化RNA连接反应，其中包括T4 DNA连接酶（T4 Dnl）、T4 RNA连接酶1（T4 Rnl 1）和T4 RNA连接酶2（T4 Rnl 2）。这种连接过程需要线性RNA前体上的受体区域（acceptor substrate）拥有3’-OH，以及供体区域（donor substrate）拥有5’单磷酸。LARONDE公司主要采用的是T4 Dnl/Rnl连接策略合成环状RNA。
 

T4 Dnl连接酶

T4 Dnl能够连接双链DNA或DNA/RNA杂交链，通常需要使用与连接位点互补的DNA（cDNA）模板或cDNA“桥”（bridge）来实现。尽管这种方法具有高连接准确性，但它对线性RNA前体在连接位点没有明显RNA二级结构和双链区域中低尿嘧啶（U）比例的要求，限制了其应用。此外，T4 Dnl对DNA/RNA杂交链的连接效率低于双链DNA（dsDNA）连接，因此实际上只有少数研究采用该方法进行RNA连接。

T4 Rnl 1连接酶

T4 Rnl 1是一种常用的RNA连接酶，催化3′-OH末端攻击激活的5′-末端，形成共价5′, 3′-磷酸二酯键并生成环状RNA。有些研究使用cDNA桥来防止线性RNA前体折叠成不适当的结构。需要注意的是，T4 Rnl 1对5′端和3′端核苷酸的偏好不同：3′端核苷酸受体A > G ≥ C > U，而5'-末端核苷酸供体为pC > pU > pA > pG。通过这种方法，可以合成包含6至8个核苷酸的环状RNA。该方法可实现高效的单链RNA（ssRNA）连接，但对大RNA分子的连接效率较低。

T4 Rnl 2连接酶

T4 Rnl 2也可用于RNA连接，其对双链RNA (dsRNA)的切口效率较高。当线性RNA前体折叠成二级结构并且连接位点位于双链区域时，T4 Rnl 2的效率远高于T4 Rnl 1。此外，使用RNA夹板，T4 Rnl 2还能实现ssRNA末端的连接，尽管不适用于较短的RNA前体。然而，T4 Rnl 2连接效率对大RNA分子较低，且分子间末端连接（寡聚化）副反应无法完全避免。这种问题可通过软件模拟目标circRNA的二级结构，并在特定位点切割以形成分子内碱基对来解决。

需要注意的是，T4连接酶连接效率较低，且可能需要使用夹板链或辅助链，不利于后续纯化和工业化生产。因此，一种借助内源性夹板链制备circRNA的方法已经出现，该方法通过末端互补配对形成二级结构，然后使用T4 RNA ligase 2连接分子内环结构。

总之，T4 Dnl和T4 Rnl 1适合没有复杂二级结构的RNA连接。T4 Rnl 2则更适合连接位点在双链区域的线性RNA前体。因此，选择不同的T4连接酶需根据线性RNA前体的二级结构。然而，所有这些酶促连接方法都不能实现大RNA分子的连接，并且无法完全避免分子间末端连接副反应。这些问题仍需进一步研究和解决。

 

核酶  

I型内含子自剪接系统

核酶修饰是合成环状RNA的一种常见方法，其中常用的是I型内含子自剪接系统，也被称为PIE方法（permuted introns and exons）。美国Orna Therapeutics公司的环状RNA合成平台即采用了这种方法，通过改造鱼腥藻（Anabaena）I型内含子自剪接核酶实现体外合成长编码环状RNA。国内许多公司也是基于此策略开发了自己的环状RNA合成技术。

 

PIE方法的魅力在于，它仅需要添加GTP和Mg2+这两种辅助因子，却展现出强大的潜力，特别是在蛋白质合成方面。该方法通过常规的I组内含子自剪接反应来实现RNA连接，这涉及到两次酯交换反应以确定剪接位点。PIE方法既适用于体外环化也适用于体内环化，这为其应用提供了广泛的可能性。相对于化学连接和酶连接方法，PIE方法具有多个优势，其中之一是能够用于较大的线性RNA前体的环化。此外，PIE方法的反应条件和纯化方法相对简单。研究甚至通过设计定制的PIE转录模板实现了精确的RNA连接，使其能够高效地合成几乎任何序列的环状RNA，无需外源外显子序列。因此，PIE方法目前是应用广泛的RNA连接方法之一。

局限性

然而，PIE方法也存在一些局限性。首先，由于RNA二级结构的多样性，不同的RNA序列可能会导致最终形成的环状RNA结构差异较大，这在一定程度上限制了PIE方法的应用。其次，由于引入了外源外显子序列，最终形成的环状RNA序列与原始线性RNA前体的序列存在差异，这可能对某些环状RNA的功能验证产生负面影响。

II型内含子自剪接系统

II 型内含子自剪接核酶同样可以用于合成 circRNA，这涉及到反向剪接反应。在这个剪接过程中，外显子的 5' 剪接位点与同一外显子的 3' 剪接位点连接起来。与 I 型相比，对于 II 型内含子自剪接核酶催化的反向剪接来说，所有外显子序列都是可有可无的。因此，这个方法可以实现更准确的线性RNA前体连接。然而，这种方法在连接位点上形成 2',5'-磷酸二酯键，而不是天然的 3',5'-磷酸二酯键，其体外机制目前还不清楚。关于 II 型内含子自剪接核酶的研究目前还相对较少。但是也有商业化公司利用II 型内含子自剪接核酶搭建了体外环化平台。

 

发夹核酶（HPR）

发夹核酶（HPR）法可以通过滚环反应和环状单链 DNA 模板的自剪接反应来产生 circRNA。带有 HPR 的线性 RNA 前体将折叠成两种替代的切割活性构象，以去除 3' 端和 5' 端。中间体将含有 5'-OH 和 2', 3'-环状磷酸盐，从而产生目标 circRNA。在这种方法中，通过体外滚环机制由RNA聚合酶进行长重复RNA的转录，以生成小型 circRNA。这种方法主要用于高效生产小型 circRNA。

然而，该方法存在一些缺点，包括 circRNA 的不稳定性，这是由于 HPR 催化的切割和连接的动态平衡所导致的。此外，由于 circRNA 含有 HPR 序列，这可能会对某些 circRNA 的功能产生负面影响。

使用 I 型内含子自剪接核酶的 PIE 方法适用于目前大多数 circRNA 的生产，但仍受到线性RNA前体二级结构的限制。而 II 组内含子自剪接方法可以实现更准确的线性RNA前体连接，但其体外机制目前仍不为人了解。HPR 方法可以有效地产生小型 circRNA，但存在产物不稳定和外源 HPR 序列的问题。在这些核酶方法中，PIE 方法显示了 circRNA 生产的潜力。目前，PIE 方法已广泛应用于基础研究和工业生产。

    其他尝试和优化  

嵌入非天然核苷酸

虽然PIE方法已经实现了精确的线性RNA前体连接，但线性RNA前体的结构仍然会对环状RNA的产量产生显著影响。

为了解决这个问题，可以尝试在线性RNA前体中嵌入非天然核苷酸，以改变其二级结构并提高连接效率。

此外，RNA结合蛋白（RBP）的使用也可能有助于RNA的环化。

连接酶的设计优化

在连接酶的设计方面，尽管来自噬菌体T4的天然酶已经能够用于RNA环化，但仍然有许多改进的空间，特别是对于大RNA分子。通过突变或精心设计，可以提高连接酶的环化效率，尤其是对于大RNA分子。

这些改进的关键在于提高连接酶与底物RNA的结合效率和环状产物的选择性。

提高环化效率

减少环化过程中的副反应也是一个重要挑战。目前，主要的副反应是分子间末端连接反应，这种反应存在于大多数环状RNA合成方法中，而且无法完全避免。

因此，需要优化环化反应的条件，控制线性RNA前体的浓度，以减少此类副反应的发生。

此外，通过使用水凝胶或其他材料固定连接酶，可以实现反应的区室化，并提高单个RNA底物的环化效率。

如何规模化生产

随着对环状RNA的需求不断增加，需要大规模生产环状RNA。然而，增加环状RNA的产量通常需要增加连接反应组分的浓度，如线性RNA前体。然而，增加线性RNA前体的浓度会导致副反应的增加，降低目标环状RNA的产量，并增加产物纯化的难度。

因此，可能需要通过进一步优化当前的反应组分和条件来提高产量，可能基于扩大化的生产系统。此外，环状RNA生产的成本也是一个研究人员关心的问题，主要原因是昂贵的原材料，如核苷酸。一种可能的解决方案是使用细胞合成的核苷酸或直接合成线性RNA前体。然而，如何高效地纯化这些细胞合成的原材料仍需要进一步研究。

 

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