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CRISPR/Cas9由sgRNA引导至目标位点，由于其简单、灵活、高效和可复用的基因组编辑能力，已成为热门的工具。随着CRISPR技术的不断更新和发展。已经从最开始的编辑DNA到能够操作RNA；从依赖DNA双链断裂后的修复机制，到单碱基编辑；其应用也从简单的基因编辑，构建疾病相关的细胞和生物模型，扩展到了治疗应用等领域。
  CRISPR/Cas9 · CAR-T疗法

CAR-T细胞疗法是一种免疫疗法，一种改变自然免疫系统使其更有效地识别和破坏癌细胞的方法。CAR T 细胞疗法本质上使 T 细胞更好地发挥作用，并且可以是自体的（来自患者）或同种异体的（来自健康的供体）。从患者身上采集 T 细胞后，他们将改造这些细胞，使其在其表面膜上表达 CAR，该 CAR 将识别并结合该特定抗原。然后将这种经过修饰的“活药物”细胞群输回患者体内，识别并破坏血液中的肿瘤组织或癌细胞。

作为更为精确的基因组编辑工具，CRISPR基因编辑可用于提高CAR-T细胞疗法的安全性和有效性，降低有害的脱靶效应，更加有效地杀死癌细胞。CRISPR基因编辑还具有在 T 细胞中生成多个基因编辑的能力。CRISPR 在 CAR-T 治疗中的另一个关键应用是它可用于生成通用或“现成”的 CAR-T 细胞。通用同种异体 CAR-T 产品的概念无需从每个患者身上采集、编辑、扩增和输注 T 细胞，从而节省时间和资源。

自2016年首次进入人体试验以来，CRISPR-Cas9已在抗恶性肿瘤嵌合抗原受体-T细胞疗法、抗镰状细胞病和β-地中海贫血的工程化CD34造血干细胞等研究中使用。迄今为止，两种来自自体 T 细胞的嵌合抗原受体 (CAR)-T 细胞产品已获得美国食品和药物管理局 (FDA) 的批准。

由于昂贵且耗时的制造过程，自体T细胞生成和检验在很大程度上被认为是其大规模应用和临床开发的关键制约因素。因此，插入DNA 和后续的检验步骤对于工程化 CAR T 细胞至关重要。

 

 CRISPR/Cas9 · 基因治疗

基因治疗作为一种提供治疗益处的策略，包括通过破坏、校正或替换来修饰基因。自2013年，CRISPR/Cas9 在哺乳动物细胞中成功进行了基因组编辑，开启了在基因治疗中实施 CRISPR/Cas9 的可能性。

虽然病毒载体仍然是一种关键的传递载体，但 CRISPR 技术为位点特异性基因编辑提供了一种相对简单和有效的替代方案，消除了传统基因治疗引起的一些担忧。在 CRISPR/Cas 系统中，CRISPR/Cas9 是当前基因组编辑最发达和使用最广泛的工具。其相对较低的价格、易用性以及高效和精确的性能而在很大程度上取代了这些早期的进步。

CRISPR基因疗法可以在体外进行，即在患者体外对细胞进行基因修饰并重新引入，或者在体内将 CRISPR 成分直接递送到患者体内进行细胞编辑。

 

脱靶效应 · 发展的制约因素

使用 CRISPR-Cas9 系统进行基因组编辑已成为许多生物医学研究领域不可或缺的工具，并有望彻底改变遗传疾病的治疗。然而，CRISPR-Cas9 的使用，关注的一个主要方面是由 CRISPR-Cas9 在基因组中除目标位点以外的位置引起的意外突变。这样的脱靶突变可能会产生严重的后果，因为它们可能会破坏非靶向基因的功能或调节。虽然现在CRIPSR系统出现越来越多更新的版本，可以对RNA和碱基进行精准的编辑和修改。然而要想真正得到应用，造福人类，CRISPR编辑工具还有许多问题需要解决。

近期研究发现，CRISPR疗法编辑工程T细胞可能会引起遗传物质的大量丢失（约9%的T细胞），可能是破碎的DNA不能总是被良好恢复。这种风险可能会促进恶性肿瘤的发展。这些发现再一次说明了后续基因组检测的必要性。

在CRISPR技术优化、编辑细胞、开发疗法的过程中，必须进行各种策略的优化，例如仔细选择靶位点、优化 sgRNA 设计和 Cas9 活性、脱靶检测分析等，以最大限度地降低脱靶效应的安全风险。此外，不利的 CRISPR-Cas9 效应可能很少见，并且只发生在一小部分经过编辑的样本中。因此，为了最终确定 CRISPR-Cas9 的效果及其在体内的长期后果，需要使用灵敏的基因组分析方法，通过开发和跟踪大量样本。

 

如何检测脱靶效应

潜在的脱靶活动是 CRISPR 系统的关键缺陷。已经开发了许多类型的方法来快速而高效的检测脱靶效应。

基因编辑中的脱靶效应会带来严重风险。研究人员发现了体内/体外生化分析和基于算法的计算方法来检测和量化脱靶效应，从而提高基因编辑效率。无偏检测方法可以在整个基因组水平上检测活细胞中意外的切割位点。这些方法分为体外检测或体外全基因组测定和体内检测或基于细胞的全基因组测定。

体外检测方法

检测和量化脱靶效应的体外全基因组分析主要包括 Digenome-seq、SITE-seq 和 CIRCLE-seq。

Digenome–seq是一种稳健、灵敏且广泛使用的方法，可检测 Cas9 和其他核酸酶的全基因组脱靶效应。Digenome-seq 的灵敏度为 0.1% 或更低，需要高读取深度，这使其灵敏度较低，不适合筛选大量 gRNA。

SITE-Seq选择性富集和鉴定标记的基因组 DNA 末端以及CIRCLE-seq体外报告切割效果的环化是为克服 Digenome-seq 问题而开发的技术。

基因组中的所有 Cas9 切割位点都可以通过 SITE-Seq 方法进行定位。其中执行的 sgRNA 和 Cas9 RNP 用于在无细胞系统中切割纯化的基因组 DNA。接下来，标记上和脱靶切割片段，进行下一代测序 (NGS) 以检测脱靶位点。

体内检测方法

体外和基于细胞的编辑，条件显著不同，许多通过体外确定的脱靶在体内没有被切割（修复）；因此，有必要开发体内或基于细胞的全基因组分析，以检测真正的脱靶效应。

GUIDE-seq基于在 DSB 中掺入寡脱氧核苷酸 (dsODN)，然后是 NHEJ DNA 修复途径，随后扩增整合的 dsODN 以检测和量化脱靶效应。它有限制，比如需要高水平的测序读取深度来消除高背景的问题。GUIDE-Seq 能够检测 ChIP-seq无法识别的脱靶位点。此外，它可以检测基因组内的 RNA 引导的核酸酶独立 DSB 热点，GUIDE-seq 的效率受染色质可及性或表观遗传因素的限制。该方法能很好的模拟细胞内脱靶现象，且能找到非预测范围内的脱靶位点，高度灵敏，也可以识别易位。

 

 Abace Biology· 安必奇脱靶效应分析服务 · 

  北京安必奇生物建立了高效成熟的基因组编辑、高通量测序和生物信息学分析平台，为客户提供全面精确的CRISPR/Cas9脱靶效应检测和分析服务。我们的检测方法包括全基因组测序、GUIDE-Seq和CIRCLE-Seq。

我们的优势

★ 灵敏度高：能检测低频脱靶突变

★ 准确性高：检测结果可通过实验验证

★ 多种检测方法可选择以满足不同的实验需求

 

 

参考文献[1]Naeem M, Majeed S, Hoque M Z, et al. Latest developed strategies to minimize the off-target effects in CRISPR-Cas-mediated genome editing. Cells, 2020, 9(7): 1608.

[2]Uddin F, Rudin C M, Sen T. CRISPR gene therapy: applications, limitations, and implications for the future. Frontiers in oncology, 2020, 10: 1387.

[3]Höijer I, Emmanouilidou A, Östlund R, et al. CRISPR-Cas9 induces large structural variants at on-target and off-target sites in vivo that segregate across generations. Nature communications, 2022, 13(1): 1-10.

[4]Nahmad A D, Reuveni E, Goldschmidt E, et al. Frequent aneuploidy in primary human T cells after CRISPR–Cas9 cleavage. Nature Biotechnology, 2022: 1-7.

 

 

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