随着科学技术的蓬勃发展，出现了很多前沿交叉学科。合成生物学是其中之一，设计改造甚至重新合成生物体，主要涉及基因工程、系统生物学、生物化学、生物信息学、计算机科学和工程学等多种学科。

高效精准的基因组编辑技术，作为改造或创制生物的重要手段，是合成生物学中关键的技术支持和难点之一。通过对底盘生物基因组进行精简、插入或重构，改造已有细胞或设计并创建新的生物元件，使底盘生物实现其特定的生物学功能，在医学、制药、化工、能源、材料、农业等领域都有广阔的应用前景。下面介绍微生物基因组编辑在工业生产和工业生物技术中的应用和进展。

 

Part.01

微生物基因组编辑在工业生产中的优势

合成生物学的理念是对细胞的定向和高效干预。通过人工设计微生物的代谢网络，优化元件与底盘的适配性，达到对代谢流量的精细化调控，从而构建贴近理想化状态的“细胞工厂”，实现目的产物在质量和数量上的最优化生产。

此外，工业化生物生产的规模可达千万吨级，高密度生长和呼吸作用产生的热量会导致系统升温、酸碱值波动、微生物活力下降或自溶等问题。因此，需要大量的冷却操作和设备进行降温，同时补加酸碱来维持微生物的生长代谢活动，这无疑增加了生产过程的难度和成本。

利用基因组编辑技术和统筹优化策略的系统改造，使其能从源头上减少甚至彻底解决以上问题。优化后的工业微生物可以：

• 适应大规模发酵导致的高温环境

• 在非最优生长环境中（无灭菌，高渗透压，高生长密度等）利用各种前体化合物，减低原先生产工艺的复杂性

• 减少代谢环节，以最高的代谢效率获得目标产物

• 打破原有代谢系统限制，实现高效生物转化

综上，利用微生物基因组编辑技术可以更微型化、循环安全地定向进化微生物，使其生产人类和企业想要的各种产品，包括小分子和大分子聚合物，非天然多肽、生物活性蛋白、化学品、生物燃料和生物材料等各种原材料和产品。据估计，生物制造已经可以覆盖70%左右化学制造产业的产品。

 

Part.02

微生物基因组改造技术：CRISPR/Cas9

自然界中的微生物总是通过各种各样的保护机制，使它们能够与恶劣的环境及侵袭性核酸共存。许多微生物都能通过基于基因序列特异性的方式抵抗核酸入侵。CRISPR/Cas9即是属于这种保护机制之一（图2）。近年来，CRISPR基因编辑技术的飞速发展更为微生物基因组编辑带来了新的机遇。CRISPR/Cas9系统中的sg RNA能够特异性靶向目标DNA序列，根据不同需要引入Cas蛋白（及其突变体或具有特定功能的融合蛋白），就能够实现目标基因的切割、抑制、激活、编辑和突变。这类技术的可推广性远远高于同源重组技术，目前已经被证明适用于包括古细菌在内的十余种重要的模式微生物。

 

Part.03

CRISPR/Cas9在工业生产中的应用

CRISPR/Cas9技术已广泛用于工业生产中的微生物基因组改造。目前，CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑已经用于各种真菌和细菌开发和合成非天然和天然产物、以及优化次生代谢物的生物合成途径。

1.   CRISPR/Cas9在大肠杆菌基因编辑中的应用进展

大肠杆菌（Escherichia coli）由于其易于培养、增殖时间短、对环境的耐受性强、基因操作容易等特点，是工业发酵研究中重要的模式生物。

有大量的CRISPR/Cas9系统被应用于提高目标产物生产效率的研究。利用CRISPR/Cas9基因编辑平台通过敲除丙酮酸羧化酶基因（ppc）、脂酰辅酶A合成酶基因（fad D）等，使脂肪酸产量增加了3.7%。此外，在大肠杆菌中利用CRISPR/Cas9技术敲除了丙酮酸甲酸裂解酶（pflb）、乳酸脱氢酶（ldh A）、乙醇脱氢酶（adh E）和转录调节因子（fnr），降低副产物的生成，并过表达转氢酶基因（pnt AB），使聚羟基脂肪酸酯在摇瓶中产量达到32 g/L。

此外，利用基因组编辑可以优化工业大肠杆菌不耐受强酸、有机溶剂和噬菌体等缺点，在一定程度上提高目的产物的产量或降低噬菌体污染风险。使用CRISPR/Cas9技术在大肠杆菌基因组中插入了非编码RNA基因（dsr A）和DNA结合转录激活因子基因（rcs B），可以提高大肠杆菌耐受性，适用于大规模生产。

2.   CRISPR/Cas9在酿酒酵母基因编辑中的应用进展

使用CRISPR/Cas9技术完全敲除酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的乙醇脱氢酶基因（ADH2），使生物乙醇的产量提高了74.7%。此外，酿酒酵母也是常用工业生产微生物，不仅可以生产酒精，还常常作为合成生物学和代谢工程等领域的宿主菌，生产多种高附加值化学品。一个基于CRISPR/Cas9的无克隆工具包被研究人员开发出来，该工具包包括了23个Cas9-sg RNA质粒、37个表达强度和表达时间不同的启动子以及10个蛋白质定位、降解和助溶标签，系统性解决了酵母大规模生产过程中产量和溶解度低的问题，优化了紫杉醇合成酶的表达，使紫杉二烯的产量提高了25倍。

 

Part.04

微生物基因组改造在工业生产领域的发展方向

合成生物学作为新近迅速发展的交叉学科, 已在生物医药、能源、化工、新材料等领域展现越来越广泛的应用潜力。虽然基因组编辑技术在合成生物学领域已经有了诸多的应用，但是依然存在技术限制和改善空间。

• 开发多种正交系统可以实现对不同基因不同方向的表达调控，这对于优化基因网络具有十分重要的意义

• 开发新型的基因表达控制系统（例如小分子诱导或者光控），以及广泛运用布尔逻辑门，提高对目的基因调控的精准性

• 扩展和优化微生物基因组编辑策略，包括提高编辑效率的碱基编辑器和引导编辑器等不产生双链断裂技术和实现高效插入和删除的CRISPR系统与重组酶结合策略等，从而改良菌种、优化更多的生物合成路径

 安必奇 · 微生物基因组编辑定制服务

微生物已被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品、酶制剂以及各种化合物等。对工业微生物开展的基因组研究，不断发现新的特殊酶基因及代谢过程和代谢产物生成相关的功能基因，可以将其应用于生产以及传统工业、工艺的改造，同时推动现代生物技术的迅速发展。

安必奇生物推出基于Rec同源重组法的微生物基因组改造服务和利用CRISPR/Cas9平台（包括基因敲除、定点突变、定点插入外源序列等）的一站式微生物基因组改造服务。

 

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01

服务物种

大肠杆菌、沙门氏菌、链霉菌、梭菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、丝状真菌等多种微生物

 

02

客户提供信息

改造的菌株及相关信息靶基因的名称或靶序列 03

我们的优势

多基因编辑：能同时敲除多个基因

便于筛选：不要求靶细菌具有抗生素抗性

定制服务：公司可以代为开发针对该物种的CRISPR基因组编辑系统或利用常规同源重组方法的基因组编辑系统

省时省钱：在先进的实验设备和完善的技术支持下，让您在短时间内，用少量的钱获得服务。

 

04

下游应用

抗生素及重要工业用酶

微生态调节剂参与食品发酵的工业化生产

 

 

参考文献

[1]Süntar I et.al, Bioproduction process of naturalproducts and biopharmaceuticals: Biotechnological aspects. Biotechnol Adv. 2021[2] SinghR et.al, Application of CRISPR/Cas System in the Metabolic Engineeringof Small Molecules. Mol Biotechnol. 2021[3] Su Y et al. Bacillus subtilis: a universal cell factory for industry, agriculture, biomaterials and medicine. Microbial Cell Factories. 2020

[4] MougiakosI et al. Hijacking CRISPR-Cas for high-throughput bacterial metabolicengineering: advances and prospects. Curr Opin Biotechnol. 2018

 

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