本文主要讲解了重组蛋白表达的一些知识点。
  1．     重组蛋白分类 

A.按蛋白分类	B.按种属分类
a. 细胞因子 (Cytokines)	a. 人 (Human)
b. 生长因子 (Growth Factors)	b. 小鼠 (Mouse)
c. 趋化因子 (Chemokines)	c. 大鼠 (Rat)
d. 激素 (Hormones)	d. 猴 (Rhesus Macaque)
e. 神经营养因子 (Neurotrophins)	e. 猪 (Porcine)
f. 酶 & 酶抑制剂 (Enzymes & Inhibitors)	f. 狗 (Canine)
g. 其他 (Others)	g. 牛 (Bovine)
B. 按种属分类	h. 其他(Others)

　　2．重组蛋白表达体系

　　MCE 重组蛋白表达体系主要有：大肠杆菌，酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞。

　　3．重组蛋白纯度和浓度测定

　　重组蛋白纯度测定方法：a. SDS-PAGE 测定法；b. HPLC 测定法；c. 银染测定法。

　　重组蛋白浓度测定方法：a. Bradford 蛋白定量测定法；b. BCA 蛋白定量测定法；c. SDS-PAGE 蛋白定量测定法。

　　4．重组蛋白运输状态

　　MCE 的大部分重组蛋白产品为冻干粉，在室温环境中都是稳定的，一般采用蓝冰或是室温运输。

　　5．重组蛋白表达体系对比

表达体系	优缺点
原核体系	繁殖快、成本低，产量高，但不能进行糖基化修饰，常为包涵体
哺乳动物细胞	结构与天然蛋白最接近，完善的翻译后加工，活性更好，但表达水平较低，周期长，技术要求高
酵母细胞	易操作，蛋白背景弱，适合大规模生产，便于纯化，但存在产量不高以及糖基化达不到要求等问题
昆虫细胞	功能与天然蛋白相似，对于部分有毒性或较难表达蛋白有优势，但糖基化程度低，形式比较单一，活性不如哺乳动物细胞表达系统

　　6．重组蛋白表达体系选择

研究目的	蛋白要求	最适表达系统
用作抗原，获得特异性抗体	纯度>80%，不需要蛋白修饰或天然活性，可带标签	原核表达体系
用于检测蛋白质结晶及晶体结构研究	纯度>95%，浓度通常在 10 mg/mL	2/3 是原核表达体系，1/3 是昆虫细胞表达体系与哺乳动物细胞表达体系
蛋白的功能研究	需要保存蛋白的天然活性	原核表达体系和真核表达体系
用于药物研究的蛋白质	一般要求尽量保存天然序列，具有天然活性	真核表达体系

　　7重组蛋白开盖使用前处理

　　为防止冻干粉产品的粉末沾在管壁或管盖上，使用前请勿开盖，离心(约13000 rpm)处理 20-30 秒，使附于管盖或管壁的蛋白收集于管底。MCE 保证每管产品的蛋白总量达到标示含量。

　　8．重组蛋白复溶

　　a. 使用前先离心(约 13000 rpm)处理 20-30 秒，使附于管盖或管壁的蛋白收集于管底。

　　b. 严格依据说明书，使用推荐的溶液将蛋白冻干粉溶解至推荐的浓度。大多数重组蛋白建议溶解在灭菌超纯水中，浓度不低于 100 μg/mL，以便于后续进一步稀释至工作浓度。

　　c. 用移液枪轻吹混匀，或将管盖盖好后轻柔颠倒数次进行混匀，低速离心数秒。

　　d. 复溶后的重组蛋白在室温放置数分钟，以保证蛋白能够充分溶解。

　　9.重组蛋白储存

　　由于每次冻融都会造成蛋白的部分变性，因此建议客户收到产品后适量分装避免反复冻融。

　　a. 短期储存：冻干粉状态产品在室温下存放 3 周，不影响活性。复溶后的产品在 4℃ 可稳定储存 1-2 周。

　　b. 长期储存：冻干粉状态产品在 -20℃ 下，可稳定保存至少一年；推荐 -80℃ 长期保存，以获得更稳定性能的产品。可选择包含一定浓度载体蛋白(0.1% BSA， 5% HSA， 10% FBS，或 5% 海藻糖)的溶液或培养基复溶产品，分装后冻存于 -20℃ 下，可保存至少三个月；推荐 -80℃ 长期保存，以获得更稳定性能的产品。注：分装冻存时，蛋白浓度不低于 100 ng/μL，且每管的体积不可小于 20μL。

　　10．载体蛋白介绍

　　载体蛋白主要用于提升重组蛋白复溶后的稳定性，同时也有利于避免产品粘附在管壁上。例如：HSA, BSA。

　　11.重组蛋白标签影响

　　蛋白标签指重组蛋白制备过程中与目的蛋白融合表达的蛋白或多肽。MCE的重组蛋白产品大部分为无标签状态，但少数重组蛋白产品因为不同目的需要加有标签。

　　a. 标签利于蛋白纯化。

　　b. 当目的蛋白无特定抗体直接鉴定，可利用标签进行 Western Blot 或ELISA 分析方法鉴定。

　　c. Fc 标签可以提升重组蛋白的半衰期以提高分子的稳定性，同时也能够促进重组蛋白形成活性二聚体。重组蛋白标签对蛋白的生物学活性影响存在未知结论，但对大部分检测应用中，重组蛋白的标签对蛋白本身生物学活性并无影响，所以无需移除。MCE 对重组蛋白产品都已经做过生物学活性检测并将数据公示于 COA 中。

　　12.重组蛋白活力值与计算方法

　　MCE 重组蛋白的生物学活性 (ED50) 测定数据在 COA 中可以获得。ED50 是Effective Dose 50 的缩写，是可诱导 50% 最大反应的蛋白浓度 (ng/mL)。

　　计算公式如下:

　　

　　MCE 的重组蛋白产品并未采用 WHO (National Institute for Biological Standards and Control) 设定的标准来测定活力值，以上计算公式并不适用于“International Units”和“ED50”的转换关系，需要采用国际标准品对比相同实验获得该重组蛋白的 IU 值。

　　13.重组蛋白 ED50 值的批间差

　　不同批次的产品或不同实验方法的测定都会导致重组蛋白产品的 ED50 值变化，我们推荐客户根据自己的实验测定得到最合适的实际 ED50 值。

　　14.重组蛋白应用方案

　　MCE 重组蛋白产品的 COA 中显示的实验方案只是确认该产品的 ED50 值，但并不与终端客户的不同类型实验结果存在等效性。如果客户需要应用在不同于本公司产品测试的实验方法时，我们建议客户通过实际测试获得最佳 ED50 值。

　　15.重组蛋白的种属交叉活性

　　重组蛋白的种属交叉活性需要根据具体产品而定；建议尽量选择对应种属的重组蛋白。如实在无法匹配种属，以下信息供参考：

　　a. 大多数人细胞因子对小鼠细胞有效 (仅少数例外)。

　　b. 多数小鼠细胞因子对人细胞有效，但特异性可能不强。如小鼠的表皮生长因子(EGF)对人的表皮细胞有活性，对人的其他种类细胞可能也有作用。

　　c. 干扰素、GM-CSF、IL-3、IL-4 具有种属特异性，即重组人的这些细胞因子只能作用于人细胞，对小鼠和大鼠等其他种而重组小鼠的这些细胞因子也仅用于小鼠，对人的细胞无效。

　　d. 成纤维细胞生长因子 (FGFs)、神经营养素 ( Neurotrophins，如 BDNGF、GDNF、CNTF、β-NGF 等)、TGF-β 等高度保守，各种属间交叉活性强。