荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization）简称FISH，是指用已知的荧光素标记的单链核酸为探针，按照碱基互补配对的原则，与待检测材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。随后在荧光显微镜下进行定性、定量或相对定位分析。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。很多公司有探针和成服务，可以直接找公司购买荧光标记的探针，也可以自己通过PCR等方法自行制备。

图1. 荧光原位杂交示意图.

下面是我们以Y染色体探针与人外周血细胞中期染色体标本为例，进行荧光原位杂交的实验操作详解。

实验材料：

Y染色体探针（通过缺口平移法制备的biotin标记探针）
人外周血细胞中期染色体标本

实验试剂：

NaCl、NaOH、柠檬酸钠、甲酰胺、吐温20、指甲油，avidin-FITC，anti-avidin，乙醇

仪器、耗材：

培养箱、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片、染色缸、封口膜、移液器、暗盒、荧光显微镜

相关溶液配制：

1、20×SSC：175.3g NaCl, 88.2g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L NaOH调pH至7.0）。
2、去离子甲酰胺（DF）：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。电磁搅拌30min，Whatmanl号滤纸过滤，棕色瓶保存。
3、70%（v/v）甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。
4、50%（v/v）甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。
5、50%（v/v）硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
6、杂交液（体积分数10% DS，50% DF，2×SSC）：8mL体积分数25%DS， 20mL 20×SSC，混合，然后取上述混合液50mL，与5mL DF混合即成，需现配现用。
7、PI/antifade溶液

• PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100mg/mL，取出1mL，加39mL双蒸水，使其终浓度为2.5mg /mL。

• Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO₃调pH值为8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混匀。

• PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1：9比例充分混匀，-20℃保存备用。

8、封闭液I：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL，混合。
9、封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL，混合。
10、洗脱液：100mL 20×SSC，加水至500mL，再加Tween20 500 mL。

实验步骤：

1、探针变性
将探针在75℃恒温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。

2、标本变性
（1）将制备好的染色体玻片置于50℃培养箱中，烤片2～3h。
（2）取出玻片标本，浸于70～75℃、体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。
（3）按顺序将标本经体积分数70%、90%和100%的冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。

3、杂交
将已变性的DNA探针10µL滴于已变性脱水的玻片标本上，盖上盖玻片，用Parafilm（封口膜）小心封片，置于潮湿暗盒中，37℃培养箱中杂交过夜（约15～17h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

4、洗脱
（1）杂交次日，将标本从37℃培养箱中取出，轻轻揭掉盖玻片。
（2）将已杂交的玻片标本置于42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
（3）在42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。
（4）室温下，将玻片标本置于2×SSC中轻洗一下。
此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低背景。

5、杂交信号的放大
（1）加150µL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
（2）去掉保鲜膜，再加150µL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。请注意，后续的步骤都需要避光处理！！
（3）取出标本，将其放入42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。
（4）加150µL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。
（5）去掉保鲜膜，加150µL anti-avidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。
（6）取出标本，将其放入42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。
（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于室温下2×SSC中清洗一下。
（8）取出玻片，自然干燥。
（9）将200µL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

6、封片
可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖玻片与载玻片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖玻片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

7、荧光显微镜镜检
先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，经FITC标记的探针所在位置发出绿色荧光。

附：探针的生物素标记

本实验采用缺口平移法，以biotin-14-dATP标记探针。标记好的探针可以在-20℃下长期保存。

1、10X dNTP：500 mmol/L Tris · HCl (pH 7.8), 50 mmol/L MgCl₂, 100 mmol/L β-硫基乙醇, 100 mg/ml去除核酸酶的牛血清白蛋白, 0.2 mmol/L dCTP, 0.2 mmol/L dGTP, 0.2 mmol/L dTTP, 0.1 mmol/L dATP, 0.1 mmol/L biotin-14-dATP。

2、10X Enzyme Mix： 0.5 units/mL DNA聚合酶I, 0.075 units/mL Dnase I, 50 mmol/L Tris · HCl(pH 7.5), 5 mmol/L醋酸镁, 1 mmol/L β-硫基乙醇, 0.1 mmol/L PMSF, 50%（v/v）甘油, 100 mg/mL牛血清白蛋白。

3、总反映体积50 mL：DNA 1 mg, 10X dNTP 5 mL, 10X Enzyme Mix 5 mL。

4、将上述混合液于16℃作用1 h。用8.0 g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电检测标记产物。以DNA片段长约300～500 bp为宜。如片段较大，则应加适量Dnase I继续酶切，直至DNA片段长度适中后，加5mL终止缓冲液（300mmol/L EDTA）终止反应。用乙醇沉淀的方法将探针与非掺入的核苷酸分开。