背景

大肠杆菌（Escherichia coli），又名大肠埃希氏菌，为Escherich在1885年发现的。大肠菌是一种条件致病菌，在一定条件下能够引起人和多种动物的胃肠道/尿道等多种组织器官感染。大肠杆菌属于大肠菌型厌氧革兰氏阴性细菌，通常存在于生物肠道中。大多数大肠杆菌菌株是无害的，但某些血清型可导致宿主严重食物中毒。

图1. 大肠杆菌。

无害的大肠杆菌是正常肠道菌群的一部分，与该生物体共生，可以通过产生维生素K2有益于身体，并防止病原体在肠道中扩散。大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌株。它具有遗传背景清晰，培养操作简单，转化和转导效率高，生长繁殖快，成本低，靶蛋白快速大规模生产等优点。而且，外源基因产物的表达水平远高于其他基因表达系统，并且表达的蛋白质量可以超过细菌总蛋白质的30％。 因此，大肠杆菌表达系统是使用最广泛的蛋白质表达系统，市售的大约30%的重组蛋白产品都是由大肠杆菌系统生产而来。

表1.大肠杆菌与其他表达系统比较

	优点	缺点
大肠杆菌	表达背景清楚，表达水平高、操作简单，培养周期短，抗污染能力强	不能进行翻译后的修饰加工，含有大量内毒素
哺乳动物表达系统	可以使蛋白正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等加工修饰，更接近于天然蛋白	产率低，某些糖基化产物不稳定、不易纯化，费用昂贵
酵母表达系统	使用简单，表达量高，可大规模生产，可对异源蛋白修饰	酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题
昆虫表达系统	高效表达，完善的加工修饰，易从无血清上清中纯化蛋白，无内毒素	外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下，由于病毒感染，细胞开始死亡，无法进行连续性表达

尽管有许多优越性，但大肠杆菌表达系统有一些限制，比如外源蛋白容易被宿主蛋白酶攻击，或者蛋白不能正确折叠形成包涵体。一些优化策略可以用来解决这些问题，比如表达稀有密码子、应用融合标签，降低包涵体形成、改变表达菌株、单一蛋白技术、自诱导以及高密度细胞培养等。

大肠杆菌蛋白表达原理

1. 表达载体

小型环状DNA可以自我复制。完整的质粒载体必须具有复制起点，启动子，插入的目的基因，筛选标记和终止子。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体，前者是在目标蛋白的N端/C端添加特殊的序列，从而促进蛋白的可溶性和正确折叠，方便目的蛋白的快速亲和纯化，或者目标蛋白的表达定位。His和GST-是最常使用的融合标签。

2. 表达宿主菌

表达蛋白质的生物即为大肠杆菌。宿主细菌的选择主要基于宿主细菌的特征和靶蛋白的特征。例如，靶蛋白需要形成二硫键。可以选择Origami 2系列，Origami可以显着增加在细胞质中形成二硫键的可能性，并提高蛋白质的溶解度和活性。

大肠杆菌表达系统种类

1. T7大肠杆菌表达

T7大肠杆菌表达表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的。但是如果目的基因对大肠杆菌有毒性，则会影响细胞的生长。T7大肠杆菌表达是用T7启动子和T7 噬箘体转录体系的元件构建的表达系统。T7 RNA聚合酶是高活性RNA聚合酶，mRNA的合成速度是大肠杆菌中RNA聚合酶的五倍，并且某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶转录的序列也可以被转录，因此T7RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的存在的情况下，大肠杆菌本身的转录系统竞争不过T7噬箘体转录体系，最终受 T7噬箘体启动子控制蛋白转录。

2. Lac和Tac大肠杆菌表达系统

Lac和Tac大肠杆菌表达系统是最早建立的表达系统。它是一种基于大肠杆菌紫胶操纵子调控机制设计和构建的表达系统。紫胶操纵子具有多顺反子结构。在没有诱导剂的情况下，负调控因子lacI基因产物与启动子下游的操纵基因紧密结合，并开始组织转录。在诱导物IPTG的存在下，与阻遏物结合后，与操纵子结合的能力降低并解离，从而激活了lac操纵子的转录。用tac启动子构建的表达系统称为Tac表达系统。为了能够严格调节Lac和Tac表达系统，将能够产生过量lacI阻遏蛋白的lacI基因的突变型lacIq应用于表达系统。然而，当使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍然观察到更高水平的背景转录，并且将lacIq基因插入表达载体中以确保更多的lacI阻遏蛋白产生。

目前，许多商业表达载体是在Lac和Tac表达系统的基础上改进和发展的。 Lac和Tac表达系统使用IPTG诱导转录，但是由于IPTG本身的毒性，从安全角度考虑，它不适合用于医学目的表达和制备重组蛋白。一些国家还规范了供人类使用的重组蛋白的生产。 IPTG无法用于生产过程，因此认为阻遏蛋白lacI的温度敏感突变体lacI（ts）可以应用于Lac和Tac表达系统。这些突变基因可以插入表达载体或整合到染色体中以实现lac。tac启动子的转录受温度严格调节，在较低温度（30°C）下受到抑制，而在较高温度（42°C）下开放。乳糖也可以代替IPTG诱导剂使用，但是其效率受多种因素的影响，并且受限制，因此乳糖导的有效剂量比IPTG高得多，乳糖本身可以被大肠杆菌作为碳源代谢。乳糖的存在还可以引起细菌的生理和生长特性的变化。

3. PL和PR大肠杆菌表达系统

以λ噬箘体早期转录启动子PL、PR为核心构建的系统称为PL和PR大肠杆菌表达系统。启动子PL、PR具有很强的启动转录能力，利用它们来构建表达载体在大肠杆菌表达系统发展初期就已被提出来并加以研究。这种表达系统基于温度敏感突变体cl857的基因产物来调控PL、PR启动子的转录，该基因产物在较低温度（30℃）时以活性形式存在，在较高温度（42℃）时失活。这种表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定，这是因为菌体中没有cl基因产物，PL或PR启动子的高强度直接转录所导致。解决这个问题的办法之一是用溶源化λ噬箘体的大肠杆菌作为PL和PR启动子表达载体的宿主菌；办法之二是把cI857ts基因组装在表达载体上，这样就可以有更大的宿主菌选择范围。

由于PL和PR表达系统在诱导时不需要加入化学诱导剂，且成本低廉，因此最初几个在大肠杆菌系统中制备的药用重组蛋白质都采用这种表达系统。但是，它也有其本身的缺陷，首先是在热刺激过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中包括蛋白水解酶，因此有可能降解表达的重组蛋白。其次是大体积发酵培养菌体时，把培养温度从30℃提高到42℃比较缓慢，这种的升温方式可能影响诱导效果，影响重组蛋白的表达量。

大肠杆菌表达系统比较

表2.大肠杆菌表达系统比较

种类	优点	缺点
T7大肠杆菌表达系统	目的基因表达水平高	较高的本底表达
Lac表达系统对表达和制备	易于调控和操作	用于医疗的重组蛋白不适合
Tac表达系统	易于调控，转录水平高于 lac	对表达和制备用于医疗的重组蛋白不适合
PL和 PR表达系统	不需要加入化学诱导剂，成本又低廉，转录能力强	可能降解所表达的重组蛋白，不适合大规模培养

参考文献：

• Adams AM.; et al. In vivo production of psilocybin in E. coli. Metab Eng. 2019.