RNA干扰（RNAi）是由双链RNA（dsRNA）诱导的转录后基因沉默（PTGS），是真核生物中一种进化上高度保守的生物学机制。在RNAi途径中，dsRNA或发夹结构RNA（hpRNA）被Dicer酶加工成一个21-23 nt的小RNA双链体（siRNA）。siRNA的一条链被纳入RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，另一条链保留并引导RISC切割与之序列互补的mRNA（图1）。

图1. 真核生物中RNAi介导的基因沉默（Majumdar R., 2017）

植物RNAi技术介绍1 siRNA设计

siRNA设计原则：

• 从靶基因起始密码子ATG下游50~100个核苷酸开始设计siRNA序列，越靠近3’端，基因沉默效果越好。

• siRNA序列最好为AA（Nn）UU，NA（Nn）UU和NA（Nn）NN也可以，N代表任意碱基，n为碱基数目，大约在19~29 nt之间。

• G/C含量在30%~52%之间其基因沉默效果较好。

• siRNA序列中避免连续的单一碱基及反向重复序列。

• 将设计好的siRNA序列在数据库中进行比对，保证siRNA的序列特异性。

2 siRNA合成和验证

siRNA的合成方法主要包括化学合成法、体外转录法、酶消化法、体内转录法。

• 化学合成法：以枋苷酸单体为原料，利用化学方法合成两条互补的RNA单链，然后退火形成双链RNA。

• 体外转录法：以DNA链为模板，利用RNA聚合酶体外转录获得两条单链RNA，再退火形成双链RNA。

• 酶消化法：在体外合成针对靶基因的dsRNA，再用Dicer酶或RNaseIII进行消化，得到siRNA混合物。

• 体内转录法：将siRNA质粒或病毒介导的载体转入细胞中，在细胞内表达所需的siRNA。将体外合成的siRNA转入细胞中，发挥作用若干时间后裂解细胞，提取细胞RNA或蛋白，用qRT-PCR或Western Blotting方法检测目的基因干扰效率，验证合成的siRNA是否有效，筛选有效siRNA进行后续研究。

3 siRNA的标记

为了更好的检测siRNA的转染效率及对siRNA进行定位，可将合成的siRNA进行标记：

• 荧光标记siRNA：用荧光标记物对siRNA双链末端进行标记，包括FAM、Cy3、Cy5等，方便观察荧光标记siRNA的移动轨迹。

• 同位素标记siRNA：用放射性同位素如γ放射性核素^99mTC或非放射同位素如¹⁸O-H₂O等对siRNA进行标记，可用同位素显像技术对siRNA的移动轨迹进行追踪。

• 生物素标记siRNA：用Biotin对siRNA双链末端进行标记，可利用标记追踪siRNA的移动轨迹。

4 siRNA载体构建

由于体外合成的siRNA进入细胞后容易被降解，持续时间较短，因此出现了依赖质粒介导的体内siRNA的表达。选择合适的siRNA载体，一般选择依赖RNA聚合酶III（pol III）启动子的表达载体。设计合成siRNA序列，合成编码siRNA的DNA模板，将模板插入siRNA载体pol III启动子的下游。siRNA载体可以显著下调目的基因的表达，并且持续时间较长，同时降低合成siRNA的成本。

5 植物遗传转化

植物遗传转化是将重组质粒导入受体植物基因组中。植物遗传转化的方法众多，主要可以分为两大类，一类是外源DNA直接转化法，主要包括基因枪法、化学药剂诱导法、花粉管通道法、显微注射法、电击法等。另一类是生物介导的转化，主要包括农杆菌介导和病毒介导两种方式。

基因枪法是将DNA沉淀在细小金属珠的表面，然后特制枪将金属珠直接打入植物细胞，如玉米籽、叶片等，但是这种方式进入的DN**段整合率极低。

电击法是将DNA混合到植物细胞原生质体悬浮液中，将混合液用电场处理若干时间后将原生质体放在组织培养基中生长，再生出整株植物，但原生质体再生成植株较为困难。

花粉管通道法是将DNA沿着花粉管进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中。这种方法是我国科学家周光宇首先提出设计的，目前已广泛应用于作物转基因研究。其特点是直接简便，且DNA整合效率高。

农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，其通过Ti质粒将DNA整合进植物基因组中。与其它转化方法相比，农杆菌转化法的转化频率高，可导入大片段DNA，导入基因拷贝数低，表达效果好，能稳定遗传，且多数符合孟德尔遗传规律。

植物中RNAi途径的意义

植物中RNAi技术因具有高特异性、高效性、高成功率、高稳定性等特点，被认为是功能基因组学中很有前途的一种基因调控方式，可在不影响其它基因的情况下，以精确的方式下调靶基因的表达。植物中RNAi在维持基因组完整性和生长发育方面具有重要意义，能对影响作物经济性状的缺陷基因及不良基因进行RNA干扰，实现作物品种改良，还能抵抗引起重大经济损失的病原体、害虫、线虫和病毒的入侵。研究小RNA在调控基因表达中的作用有助于研究人员探索小RNA在非生物和生物应激反应中的潜力，通过培育抗病、环境胁迫耐受以及高产的优良品种，为作物改良开辟了新的途径。

RNAi在植物基因工程中的应用

1.植物抗病。RNAi诱导的基因沉默是设计植物抗病品系的有效工具。这种方法创造了许多抗病品种，能有效抵御由细菌、真菌、病毒所引起的疾病。HGS-hpRNAi可以通过改变植物抵御病原相关基因的表达来增加植物对细菌及真菌的抵御能力。RNA沉默作为植物天然的抗病毒机制，通过病毒诱导的基因沉默抵御病毒的入侵。

2.植物抗虫害。转基因植物通过其产生的dsRNA靶向昆虫组织的特定基因，昆虫通过食下植物组织摄入dsRNA使该基因沉默，从而导致昆虫死亡。RNAi可以有效抵御昆虫及寄生虫，为作物保护开辟了新的途径。

3.作物品质改良。RNAi作为一个新的方法，通过改变植物基因的表达，在作物品质性状和营养改良方面具有很大的潜力。利用RNAi技术可以改变观赏性植物的结构，培育无籽果实（图2），改变植物花期、花色及气味。同时RNAi可作为代谢工程工具，用于生产和合成具有商业价值的植物产品，例如生物碱的生产（奎宁、长春新碱）、精油和香兰素等的生物合成。

图2. RNAi技术培育无籽番茄（Molesini B., Plant Physiol. 2009）

4.非生物胁迫耐受。目前的研究表明，RNAi在不同作物的非生物胁迫刺激中发挥着重要作用。对拟南芥的研究发现miRNA（microRNA）在氧化应激、寒冷、干旱和盐性等非生物胁迫中均发挥功能。此外，拟南芥中有7种miRNA参与了应答UV-B的应激反应。对美洲黑杨（P. trichcarpa）的研究发现，miRNA可能受到机械压力的调控，在机械压力防御系统中发挥功能。

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服务内容

RNAi诱导的植物基因沉默

植物遗传转化服务

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参考文献：

[1] Qigao Guo, Qing Liu, Neil A. Smith, Guolu Liang, Ming-Bo Wang. RNA Silencing in Plants: Mechanisms, Technologies and Applications in Horticultural Crops[J]. Current Genomics, 2016, 17(6), 476-482.

[2] Adnan Younis, Muhammad Irfan Siddique, Chang-Kil Kim, Ki-Byung Lim. RNA Interference (RNAi) Induced Gene Silencing: A Promising Approach of Hi-Tech Plant Breeding[J]. International Journal of Biological Sciences, 2014, 10(10): 1150-1156.

[3] Rajtilak Majumdar, Kanniah Rajasekaran, Jeffrey W. Cary. RNA Interference (RNAi) as a Potential Tool for Control of Mycotoxin Contamination in Crop Plants: Concepts and Considerations[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 200.

[4] 金万枚, 巩振辉, 李桂荣, 张桂华. 植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定[J]. 陕西农业科学, 2000,1:25-26.

[5] Barbara Molesini, Tiziana Pandolfini, Giuseppe Leonardo Rotino, Valeria Dani, Angelo Spena. Aucsia Gene Silencing Causes Parthenocarpic Fruit Development in Tomato[J]. Plant Physiology, 2009, 149

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