上个世纪20年代，科学家发现植物与病毒之间存在交叉保护现象：被病毒侵染后的植物很可能产生对该病毒株系和相近株系的抗性。但这种抗性也可能存在“恢复”的现象。直到上世纪90年代，这些现象的产生机制才被逐渐阐释清楚：是由于病毒基因发生了转录后基因沉默而致使表达受到抑制的结果。这种现象因此被称为“病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）”。基于这种机制的启发，人们尝试将植物基因片段插入到病毒载体中，侵染植物达到实现基因表达的抑制。经过多年的研究与发展，该技术已经逐渐成熟，并广泛用于植物基因功能研究和植物遗传改良应用。

VIGS的作用机制

VIGS的作用机制与另一种常用的基因沉默技术——RNA干扰（RNAi）有很多相似之处。相较于RNAi，基因沉默具有快速、高效、通量高等优点。VIGS是利用携带目的基因的cDNA片段的病毒载体侵染植物，病毒在植物体内的复制和转录能特异性诱导和插入片段序列同源的mRNA降解或者诱导其被甲基化等修饰，导致其不能正常翻译，从而引起植物表型或者指标发生变化。具体地，病毒在植物体内的复制和表达过程中会形成双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）。dsRNA 首先被Dicer类似物（DCL，如DCL4）的RNase-III家族特异性核酸内切酶切割成小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）。siRNAs进一步扩增，并以单链形式与Argonatute（AGO）RNA结合蛋白和RNase结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC能与同源RNA特异性互补结合，导致同源mRNA降解，发生转录后水平的基因沉默。或者，RISC能与细胞核内的同源DNA相互作用导致其被甲基化修饰，发生转录水平的基因沉默。研究发现，后者引发的基因沉默是可遗传的。

图2. 病毒诱导的植物基因沉默机制。

VIGS的优点

1. 简单易操作，不需要遗传转化和突变体获取。

2、速度快，高通量，成本低，常用于规模化研究植物基因功能。

3、应用广泛。VIGS已经在很多植物研究中取得了成功，包括模式植物如本氏烟和拟南芥，以及非模式植物如小麦，水稻，玉米，番茄，葡萄，柑橘，苹果等。

4、研究领域广泛：植物生长发育、抗病抗逆、代谢调控等相关基因的功能鉴定；植物形状改良；植物保护。

VIGS的工作流程

1. 选择目的片段。根据研究需要，精确找到目的基因。确定好目的基因序列后，选择插入片段。 插入片段一般不超过1.5kb，否则构建的载体不稳定，以300-500bp最合适。插入序列与目的序列至少需要有23bp完全一致。有些基因以基因家族形式存在，如果只想沉默该家族的特定基因，要选择特异性序列设计插入片段，如果想要沉默多个基因，可选择该家族的保守区序列。

2. 病毒载体构建。病毒载体应该易感于宿主且易接受外源基因，能在宿主内复制增值，且理想情况是病毒子代能均匀分布在器官内各个组织。相比于双子叶植物，单子叶可选择的病毒载体种类较少。构建载体时，除去非必需的基因片段，加入反式作用序列、宿主和病毒识别的序列、多克隆位点、tRNA结合位点，还可能包括泛素化的启动子，共同组成完整的沉默载体。

3. 沉默载体导入宿主。根据不同的载体、要求选择最适合的方法。接种方法可分为三大类，摩擦接种法，农杆菌介导法和微粒轰击法。摩擦接种法主要用于RNA病毒载体：体外转录或者从感染的叶片中提取病毒载体RNA，通过牙签或者石英砂处理待浸染叶片。农杆菌转化可用于DNA和RNA病毒载体：将构建好的沉默载体导入农杆菌种，通过农杆菌液接种。微粒轰击法多用于DNA病毒载体：通过基因枪，将携带重组载体的金粉等金属离子轰击导入宿主。

4. 侵染后的植物培育。需要根据载体、植物确定最适培育条件，可通过实验调查确定，其中温度调查最重要。

5. 沉默效果鉴定。可通过表型变化或者基因定量分析（RT-PCR、qPCR）确定。

VIGS载体

随着研究的深入和广度不断拓展，可作用于不同宿主的VIGS病毒载体陆续被发现。为VIGS的进一步发展提供了有力的支撑。

1、RNA病毒载体

用于VIGS的RNA病毒载体包括烟草花叶病毒（TMV），马铃薯X病毒（PVX），烟草脆裂病毒（TRV），大麦条纹花叶病毒（BSMV）、豌豆早枯病毒（PEBV），番茄丛矮病毒、黄瓜花叶病毒（CMV）、雀麦花叶病毒（BMV）等。TRV是应用最广的病毒载体，具有病毒症状较轻、沉默效率高和持久、各种组织都可沉默等优点，广泛用于茄科、十字花科。BMV可用于重要经济作物如大麦、玉米、水稻等的VIGS。CMV可用于大豆。

2、DNA病毒载体

利用含有DNA基因组的双生病毒载体，可直接介导质粒DNA侵染宿主，无需体外转录、且操作简单。双生病毒科的番茄金花叶病毒（TGMV）可用于本氏烟，大白菜曲叶病毒（CbLCV）可用于拟南芥，非洲木薯花叶病毒（ACMV）可用于木薯。

3、卫星病毒载体

卫星病毒具有基因组小，宿主中复制水平高，遗传造作简单等优势。自2002年起，先后出现了STMV、DNAβ、DNA1等卫星病毒，在在烟草、番茄和矮牵牛等植物种都实现了基因沉默。

影响VIGS效率的因素

1. 插入片段与靶基因的同源性。两者同源性越高，基因沉默效果越好。否则可能造成脱靶现象。如果siRNA与靶mRNA的一致性序列少于11bp，沉默效果会大大降低。一些生物软件，如siRNA-scan可用于预测和提高基因沉默效率。

2. 插入片段长度。研究表明，插入片段最好在300-500 bp之间。如果插入超过1.5 kb，可能造成插入片段丢失或者病毒失去侵染能力。

3、插入片段方向。不同的病毒载体要求可能不同。一般而言，靶基因片段反向插入的基因沉默效率高于正向插入的基因沉默效率。但是有些病毒载体不受插入片段方向影响。

4、插入片段组织方式。将插入片段构建成反向互补的形式插入载体中，在转录时形成的发卡结构会显著提高基因沉默效率。

5、环境因素。植物培养条件与沉默效果也密切相关。以温度为例，一般情况下，高温会降低基因沉默效率，而较低的温度会显著提升基因沉默效率。但是有效沉默的事宜温度因载体和宿主存在差异。

6、病毒接种方法。常见方法包括摩擦接种、微粒轰击、农杆菌介导等，农杆菌介导法又得到进一步改进，如注射法、真空浸润法等，适合不同的病毒接种情况。

 

北京安必奇生物科技有限公司致力于植物基因工程的研究，拥有多年的作物育种经验和先进的植物分子生物学技术，立志为客户提供专业的、个性化的植物基因沉默服务。我们可以提供从基因克隆、载体构建、植物转化以及随后的表型和基因功能分析等一站式的服务。

我们的服务

病毒诱导的植物基因沉默

RNAi诱导的植物基因沉默

· 稳定和操作简单：目标基因片段可以通过直接克隆连接到病毒载体中

· 实验周期短：VIGS载体通过农杆菌或基因枪介导的方法转入植物后，通常1-2周后就可看到表型。

· 费用低：VIGS的花费低且可以进行高通量的筛选。

参考文献：

[1] 李淼淼. BSMV诱导小麦SBEIIa和SSIIa基因沉默及其对直链淀粉和抗性淀粉合成的影响[D].石河子大学,2014.

[2] 徐幼平,徐秋芳,宋晓毅等.病毒诱导的基因沉默[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2008, 34(2): 119-131.

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