cDNA文库

cDNA文库指的是某生物某一发育时期所转录的全部mRNA反转录形成的cDNA克隆集合。cDNA文库与基因组文库不同，基因组文库包含了cDNA文库，还包含了非转录的基因组序列，比如重复序列等。cDNA文库包含了细胞的全部mRNA信息，利于研究基因时空特异性表达、基因调控、基因功能等。cDNA文库可用于microarray或者高通量测序应用。

均一化cDNA文库

mRNA丰度指的是某种特定mRNA在总mRNA中所占的比例。据此， mRNA按其含量分为高丰度、中等丰度和低丰度。

高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总mRNA的22%

中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总mRNA的49%

低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总mRNA的29%。

这种基因表达上的差异为研究增添了困难。高拷贝基因给基因筛选和鉴定带来了不必要的浪费，尤其是进行大规模EST测序的时候。我们可以通过一定的策略，将cDNA文库进行处理，降低高丰度和中等丰度基因的比例，使得高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致，这种cDNA文库被称为均一化cDNA文库。均一化cDNA文库有利用充分研究基因的表达和对基因进行分析。目前主要有两种策略构建均一化cDNA文库。高丰度cDNA的复性速度快，而低丰度cDNA复性时间较长。因此，可以通过复性时间来降低基因频率差异。第二种策略是基于基因组DNA的拷贝数相对均一化的性质。即可以通过cDNA和DNA饱和杂交降低高丰度cDNA的丰度。

cDNA文库流程

cDNA文库构建流程主要如下图所示，包括总RNA提取、mRNA分离、反转录合成cDNA第一链、PCR扩增合成双链cDNA、cDNA片断分离、克隆重组反应。


1 总RNA提取

构建cDNA文库，最好选取目的基因表达量最高的发育时期或者这一时期的特殊组织。将组织用生理盐水冲洗干净，剪碎，在液氮环境下充分研磨，加入Invitrogen公司的Trizol提取液，按照说明书流程提取总RNA。RNA浓度可以通过分光光度计测量，RNA质量可以通过1%琼脂糖-甲醛凝胶电泳检测。如果是真核样品，完整的总RNA具有清晰的28S和18SrRNA条带，并且28S条带的强度是18S的2倍。

完整的RNA（右）与降解的RNA（中）对比。

2 mRNA分离

可以用Invitrogen公司的FastTrack mRNA isolation Kit对符合要求的总RNA进行mRNA的分离，具体步骤请看说明书。然后用1%琼脂凝胶电泳检测mRNA质量，用紫外分光光度计测定浓度。

3 Gateway技术构建cDNA文库

mRNA纯化和质检后，还需要经过几个步骤构建cDNA文库，包括反转录合成cDNA第一链、PCR合成cDNA第二链、cDNA片断分离和克隆构建。可以利用下图流程或者直接使用Invitrogen公司的CloneMiner II cDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库。

cDNA文库构建流程示意图（Figueiredo et al. 2007）。

• mRNA反转录成cDNA的过程被称为反转录。在mRNA 中加入Biotin-aatB2-Oligo(dT) primer和 SuperScript Ⅲ RT 酶进行反转录。

• 以cDNA第一条链为模板，加入大肠杆菌DNA Ligase、大肠杆菌DNA Polymerase I、大肠杆菌RNase H以及T4聚合酶合成cDNA第二链。

• 合成双链cDNA后，加入adapter buffer、attB1 adapter、DTT，16℃孵育16-24小时，目的是在链末端连接上attB1序列。然后进行片段分离，利用的是cDNA size fraction columns，收集500-4000bp之间的双链cDNA。

• 将收集到的双链cDNA与pDONR222质粒混合，通过BP重组反应链接载体。重组产物再通过转化导入感受态细胞中，摇菌培养（37℃，220r/min，1h）获得cDNA文库。

4 文库质量检测

取细菌原液10ul，分别稀释10、100和1000倍，各取50ul涂板，37℃过夜孵育。

文库滴度（CFU/ml）=单菌落数*稀释倍数/涂布菌液体积

原始库容量（CFU）=文库滴度*文库体积（ml）

随机挑取单克隆，以M13F-M13R为引物，PCR检测插入片段大小，并估算文库重组率。
 

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安必奇采用SMART cDNA文库构建方法，将mRNA在体外反转录成cDNA，与适当质粒载体连接后转化受体菌，进行繁殖扩增。最终获得包含组织或细胞全部mRNA信息的cDNA克隆群体。到目前为止，安必奇已经具有众多SMART  cDNA文库构建的成功案例，能够构建各种材料来源的cDNA文库。我们一流的技术平台和经验丰富的专家会为您提供快速可靠的cDNA文库构建服务，并提供全面的检测报告，包括库容量、插入片段平均长度、重组效率及cDNA完整性等评价。

1，我们的优势

样本用量少- 一个样本文库的构建只需要1  μg总RNA。

全长比率高- 采用SMART cDNA文库构建专利技术，全长比率在30%以上。

库容量大- 我们的专家能够为您提供文库质量标准为 ≥1.0×106的高质量服务。

经验丰富- 安必奇经验丰富、专业精湛的专家团队为您提供最佳可靠的实验方案。

2，实验材料要求

若样品是动物组织材料，样品质量需大于5g。

若样品是植物标本，样品质量需大于20g。

若样品是培养细胞，请您提供5×107以上培养好的细胞。

若样品是Total  RNA，要保证RNA没有降解，需要通过电泳等方法进行判断，其纯度要求A260/A280≥1.8，样品总量需大于500ug。

参考文献：

Figueiredo A , Aladje Baldé, Hélia Cardoso, et al. Cost effective method for construction of high quality cDNA libraries[J]. Biomolecular Engineering, 2007, 24(4):419-421.

杨少丽, 秦松. Gateway技术构建菊芋块茎全长cDNA文库及EST测序分析[J]. 生命科学研究, 2018(5).

转载自公众号：北京安必奇生物科技有限公司