转载自公众号： 北京安必奇生物科技有限公司 2018-12-07  什么是稳定细胞系？

稳定细胞系是指将外源质粒DNA整合到宿主基因组中，使外源基因在宿主细胞中长期表达，这样的细胞系被称为稳定细胞系。与稳定细胞系相对的是瞬时表达细胞系。瞬时转染是将外源DNA导入到宿主细胞中，外源DNA不必整合到宿主染色体中，获得目的基因暂时但高水平的表达。由于外源导入的载体整合到基因组中的几率非常低，所以常以染色体外的形式存在，随着细胞分裂，外源DNA拷贝数逐渐被稀释，从而无法实现长期稳定表达。因此，两种构建转染细胞系的方法满足不同的研究和应用需求。

以下情况需要使用稳定细胞系：

1、实验周期长，要求外源DNA在分裂细胞中长期表达，>2周

2、需要构建诱导表达系统。当目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性，或者会引起细胞毒性等不利影响

3、基因敲除/插入等修饰宿主细胞基因组的实验

4、筛选拷贝数适宜的细胞

5、对于某些很难转染的细胞种类。即使病毒载体也无法实现高效率转导

6、通过构建稳定细胞株实现更好的基因干扰效果

7、后续实验中需要将转染细胞注射进入动物体内

8、需要构建单克隆细胞株可以去除个体差异

 稳定细胞系构建方法简述

稳定细胞系常用于重组蛋白生产、信号传导研究、药物靶点发现和免疫治疗药物开发等。其构建流程包括载体设计、细胞转染、筛选、扩大培养、克隆鉴定等。

01载体构建

第一步是构建含有编码目的蛋白的基因调控元件、基因序列和可筛选标记的质粒载体。卡那霉素和G418分别被用于细菌和哺乳细胞的选择性筛选。

单抗表达载体例子

02细胞转染

目前，细胞转染主要有化学介导、物理介导、病毒介导的方法。化学介导利用的原理是载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或者正电荷，主要包括DEAE、磷酸钙法和人工脂质体法。物理介导利用的原理是在宿主细胞膜表面形成一个瞬时的孔，从而导入DNA，主要包括显微注射法、电穿孔法、基因枪法。病毒介导是利用病毒侵染宿主从而导入外源DNA。

尽管显微注射的整合率高，但是对设备和技术要求高超。综合考虑，病毒转染法是最理想的细胞转染方法。常用的病毒包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒载体转染。病毒转染法主要有以下优点：

l  高转染效率（对原代细胞有80-90%）

l  可用于难转染细胞和原代细胞的稳定性转染

l  可用于体内转染

l  可用于构建稳定和瞬时表达细胞系

市面上有成熟的试剂盒供选择，请按照生产商说明书进行操作。请使用阳性对照。

03稳定克隆株筛选

转染后，将细胞在非选择性培养基中进行培养超过24h。然后用胰蛋白酶处理细胞，制成悬浮细胞液用于后续分析。在细胞培养基中加入足够的养分和适量的G418（如果前面载体构建选择的是G418）.将细胞平铺在平板上，进行转基因细胞筛选。

通常，抗性细胞的生长在2周后可以观察到，但是一些细胞可能需要长达4周的时间，每2-3天需要更换含有G418的培养基，因为G418在37℃的环境下不稳定。需要同时与阴性对照样本比较，用显微镜观察，不能有任何细胞生长迹象。

04扩大培养与表征

回收抗性细胞并扩大培养，最好选择混合稳定株或者多个不同的单克隆稳定株。可以通过摇菌的方式培养细胞悬浮液，实现高活力和高密度的细胞株扩大增殖。可以利用PCR、qPCR、western blot等方法实现从DNA、mRNA、蛋白水平的检测。

值得注意的是，稳定株中外源基因表达的质量与整合位点的转录活跃度相关，最理想的是单拷贝，且转录活性比较高。另外，不同的整合位点有不同的稳定性，可能发生重组或者丢失。所以，为了避免影响宿主细胞生长以及希望转录活性高，可以利用位点特异性整合。常用的天然重组酶和重组位点请看下表。可以通过基因编辑技术，如TALENs, CRISPR-Cas系统，或者同源重组实现。

天然重组酶和重组位点用于位点特异性整合。

重组酶	识别位点	来源	重组酶类型
Cre	Lox	噬菌体P1	酪氨酸
Dre	Rox	噬菌体D6	酪氨酸
Flp	FRT	酿酒酵母	酪氨酸
φC31	att	噬菌体φ31	丝氨酸

 参考资料：

Biopharmaceutical Processing: Development, Design, and Implementation of Manufacturing Processes[M]. Elsevier, 2018.

细胞系定制服务

构建一个有效的细胞系是一件复杂而费时的工作，安必奇作为专业的生物医药研发服务机构，拥有系列稳定细胞系构建专利技术及丰富的哺乳动物细胞培养经验，可以为您提供各种细胞系定制服务。我们已经为世界各地的客户构建了各种各样的定制细胞系，包括基因过表达（Reporter细胞系、GPCR细胞系、离子通道细胞系等）、Knockdown、Knockout细胞系等。我们深知科研工作的时间宝贵，因此致力于提高效率，提供优质高效的细胞系定制服务。我们构建的细胞系可直接应用于各种下游的生物学研究，包括基因调控、蛋白质工程、重组抗体制备、药物研发等。

技术流程

载体构建- 目的基因过表达载体的构建。

病毒包装- 表达载体、辅助质粒共转染293FT细胞，收集病毒上清，纯化和浓缩病毒颗粒。若选择转染，则跳过此步。

转染、转导- 电转染或转染试剂（脂质体等）进行细胞转染，或病毒转导。

筛选- 根据表达载体的筛选基因选择药物进行筛选，如嘌呤霉素、G418等。

扩大培养- 将筛选出的单克隆细胞进行扩大培养。

鉴定- PCR、Q-PCR、western等从DNA、mRNA、蛋白水平进行检测。

服务步骤	服务周期	交付结果
目的基因合成	1周	测序报告
目的基因亚克隆	3天	冻干粉质粒、含重组质粒的甘油菌一管、测序报告
病毒包装	1周	病毒储存液(>10^8 PFU)、重组后的病毒载体质粒
阳性克隆筛选	2周	用于筛选的药物浓度
阳性克隆鉴定	3天	阳性细胞株、测序报告、Q-PCR、western检测结果

服务内容

过表达细胞系服务

Knockdown（基因敲低）细胞系服务

Knockout （基因敲除）细胞系服务

我们的优势

多样的细胞种类- 在H1299、2F-2B、4T1、786-O、9607、THP-1、MCF7/ADR、A549、 V79、CHO、HepG2 等多个种属细胞中成功构建过表达、Knockdown和Knockout细胞系。

各种表达载体- 通过2A、IRES、多启动子、融合表达等手段，在一个质粒里实现同时表达两个或者两个以上基因。同时，还可以选择多种启动子、报告基因和亲和标签。

一站式服务- 我们提供从稳定细胞系构建至重组蛋白生产的一站式服务，满足客户不同的需求。

省时省钱- 在先进的实验设备和完善的技术支持下，让您在最短的时间内，用最少的钱获得最好的服务。

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